細胞丁酰膽堿酯酶活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

細胞丁酰膽堿酯酶活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過丁酰膽堿酯酶反應系統中釋放出巰基膽堿，使用Ellman試劑后，產生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產物，出現吸光峰值的變化，即采用比色法來測定細胞裂解樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解懸液樣品（動物、人體等）丁酰膽堿酯酶的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

 

技術背景

 

丁酰膽堿酯酶（Butyrylcholinesterase；BchE；EC3.1.1.8），440kDa四聚體糖蛋白，又稱為血清膽堿酯酶（serum cholinesterase），是一種非特異性膽堿酯酶，屬于和神經細胞乙酰膽堿酯酶等結構類似的蛋白。存在于哺乳動物，例如人體、馬、小鼠和大鼠等，尤其在人體血液、腎組、小腸、肝、肺、心臟和中樞神經系統中。丁酰膽堿酯酶主要水解丁酰膽堿，同時也能水解乙酰膽堿。其功能在于通過水解含酯藥物，去除膽堿酯酶抑制劑，例如琥珀酰膽堿（succinylcholine），達到解毒作用，最大限度減低對于神經肌肉的作用。丁酰膽堿酯酶缺失將導致各種藥物，例如可卡因（cocain）的延遲代謝。丁酰膽堿酯酶是人體血清中唯一一個作用于海洛因（heroin）的酶，經過血腦屏障，水解產生嗎啡（morphin）。丁酰膽堿酯酶以及和乙酰膽堿酯酶的活性比與注意力（attention）、執行功能（executive function）、情緒性記憶、行為、淀粉樣蛋白產生等有關，由此成為藥物治療的靶標或疾病變化的生物標記。基于人工合成底物碘化硫代丁酰膽堿（S-butyrylthio choline iodide）在丁酰膽堿酯酶的作用下，水解產生丁酸（butyrate）和硫代膽堿（thiocholine），與Ellman試劑5,5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應后，產生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過其吸收峰值的變化（412nm波長），來定量分析丁酰膽堿酯酶的活性。丁酰膽堿酯酶反應系統為：

 

    Butyrylcholinesterase 

S-butyrylthiocholine iodide        →      butyrate  +  thiocholine

                             

DTNB  +  thiocholine  →   TNB +  choline-S-S-TNB

 

產品內容

 

清理液（Reagent A） 120毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

緩沖液（Reagent C）  40毫升

反應液（Reagent D）   2毫升

底物液（Reagent E）       4毫升

陰性液（Reagent F）     2毫升

產品說明書      1份

 

 

保存方式

 

保存裂解液（Reagent B）、反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細胞刮脫棒：用于脫離細胞

微型臺式離心機：用于樣品制備

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

 

實驗步驟

 

• 樣品準備

 

• 準備好25cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

 

• 測定準備

 

• 開啟并設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長412nm，間隔5分鐘，讀數3次（共10分鐘），并置零
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

• 樣品背景對照測定

 

• 移取750微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升陰性液（Reagent F）
• 加入100微升底物液（Reagent E）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入50微升待測樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈） 
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品背景對照（10分鐘讀數－0分鐘讀數）

 

• 樣品測定

 

• 移取750微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升反應液（Reagent D）
• 加入100微升底物液（Reagent E）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入50微升待測樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（10分鐘讀數－0分鐘讀數）

 

五、計算樣品活性

 

[（樣品讀數－背景讀數）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 13.6（毫摩爾吸光系數）X 10（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾硫代膽堿/分鐘

 

• 酶標儀測定

 

• 在96孔板上做好相應標記：樣品背景對照和待測樣品
• 分別移取190微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 加入25微升陰性液（Reagent F）到樣品背景對照孔里
• 加入25微升反應液（Reagent D）到待測樣品孔里
• 分別加入25微升底物液（Reagent E）到所有孔里
• 輕輕搖動96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入10微升待測樣品（20微克蛋白）到所有孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和10分鐘讀數

 

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 13.6（毫摩爾吸光系數）X 0.6（光徑距離；厘米）X 10（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾硫代膽堿/分鐘

 

注意事項

 

• 本產品為20次（比色皿）和80次（96孔板）操作 
• 操作時，須戴手套
• 每個樣品均須背景測定
• 建議使用比色皿測定
• 樣品須澄清，至關重要
• 加樣后3秒內比色測定
• 測定值由低到高變化；測定可持續15分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測定15分鐘讀數高于0分鐘讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 丁酰膽堿酯酶單位活性定義為：在30℃，pH 8.0條件下，每分鐘內能夠生成1微摩爾硫代膽堿所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列丁酰膽堿酯酶檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感

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