細胞谷氨酸丙酮酸轉氨酶（GPT）活性酶偶聯反應光譜法定量檢測試劑盒

產品說明書（中文版）

主要用途

細胞谷氨酸丙酮酸轉氨酶（GPT）活性酶偶聯反應光譜法定量檢測試劑是一種旨在通過谷氨酸丙酮酸轉氨酶和乳酸脫氫酶的酶偶聯反應系統中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光譜法來測定細胞裂解樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物細胞裂解懸液樣品谷氨酸丙酮酸轉氨酶的總活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

 

技術背景

 

谷氨酸丙酮酸轉氨酶（glutamic pyruvic transaminase；GPT；EC2.6.1.2），又稱為丙氨酸轉氨酶（Alanine transaminase；ALT或alanine aminotransferase；ALAT），存在于各種人體組織和血液中。谷氨酸丙酮酸轉氨酶催化丙氨酸的氨基轉移到α-酮戊二酸（α- Ketoglutarate）的反應，產生丙酮酸和谷氨酸。檢測谷氨酸丙酮酸轉氨酶活性，常用于評價肝功能：GPT活性異常與病毒性肝炎、充血性心衰、肝損傷、膽道疾病、傳染性單核細胞癥有關。基于底物丙氨酸（L-alanine）和α-酮戊二酸，在谷氨酸丙酮酸轉氨酶的催化作用下，轉化成丙酮酸后，通過乳酸脫氫酶系統，測定還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）的吸光峰值變化（340nm 波長），來定量分析谷氨酸丙酮酸轉氨酶的活性。其反應系統為：

 

Alanine aminotransferase/glutamate pyruvate transaminase

α-Ketoglutarate  +  L-alanine       →      pyruvate  +  L-glutamate

         

Lactate dehydrogenase

Pyruvate  +  NADH       →      Lactate  +  NAD⁺   +  H⁺

        （高吸收峰）    （低吸收峰）

 

產品內容

 

清理液（Reagent A） 120毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

緩沖液（Reagent C）  20毫升

反應液（Reagent D）   2毫升

底物液（Reagent E）     2毫升

陰性液（Reagent F）   500微升

產品說明書      1份

 

 

 

 

保存方式

 

保存裂解液（Reagent B）、反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細胞刮脫棒：用于細胞脫離

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

比色皿或96孔板：用于光譜分析的容器

分光光度儀或酶標儀：用于光譜分析

 

實驗步驟

 

• 樣品準備

 

• 準備好25cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

 

• 測定準備

 

• 準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取懸液樣品等），置于冰槽里
• 設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長340nm，間隔60秒，讀數6次（共5分鐘），并置零
• 測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）置入冰槽里融化。緩沖液（Reagent A）在30℃溫度下均衡溫度

 

 

• 背景對照測定

 

• 移取750微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升反應液（Reagent D）
• 加入100微升底物液（Reagent E）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升陰性液（Reagent F）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（0分鐘讀數－5分鐘讀數）

 

• 樣品測定

 

• 移取750微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升反應液（Reagent D）
• 加入100微升底物液（Reagent E）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入50微升待測樣品（50微克細胞裂解懸液總蛋白）（注意：樣品須清澈，且pH為7.5）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（0分鐘讀數－5分鐘讀數） 

 

五、計算樣品活性

 

[（樣品讀數－背景讀數）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數）X 5（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾NADH/分鐘

 

• 酶標儀測定

 

• 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取190微升緩沖液（Reagent C）到相應孔里
• 分別加入25微升反應液（Reagent D）
• 分別加入25微升底物液（Reagent E）
• 輕輕搖動96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入10微升陰性液（Reagent F）或待測樣品（20微克細胞裂解懸液總蛋白）（注意：樣品須清澈，且pH為7.5）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測，包括（0分鐘初始讀數和5分鐘讀數）
• 活性計算

 

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.010（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數）X 0.6（光徑距離；厘米）X 5（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾NADH/分鐘

 

注意事項

 

• 本產品為20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，至關重要
• 建議使用比色皿測定
• 加樣后3秒內光譜測定
• 測定值由高到低變化；測定可持續5分鐘
• 光譜測定后，比色皿須清洗徹底
• 背景空對照0分鐘讀數通常0.5為理想狀態
• 背景空對照的正常讀數差值（0分鐘－5分鐘）通常為0.001至0.005（正負即可）
• 樣品0分鐘讀數通常和背景空對照0分鐘讀數一致
• 樣本測定5分鐘讀數低于0分鐘讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 谷氨酸丙酮酸轉氨酶單位活性定義為：在30℃，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠氧化1微摩爾NADH所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列細胞酶學檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感

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