破骨細胞型抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP5b）活性比色法定量檢測試劑盒

產品說明書（中文版）

主要用途

破骨細胞型抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP5b）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過酸性磷酸酶反應系統中，在酒石酸（tartrate）和特異性抑制劑存在的條件下，二氯乙酰苯基磷酸水解后產物峰值的變化，即采用比色法來測定樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物或人體細胞和組織裂解萃取液尤其是破骨細胞，以及血清等樣品中破骨細胞型抗酒石酸酸性磷酸酶的特異活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

 

技術背景

 

抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase；TRACP），屬于酸性磷酸酶（acid phosphatase；ACP；EC 3.1.3.2）家族中成員，為酒石酸抗性而與其它酸性磷酸酶區別。其分為5型和非5型酸性磷酸酶，具有分泌性。5型抗酒石酸酸性磷酸酶根據碳水化合物含量、pH理想條件、特異活性和亞基結構等，又分為5a和5b：5a在在活化的巨噬細胞和樹狀細胞（dendritic）中表達，35kD分子量，含有唾液酸糖基（sialylated），pH5.2最佳，異常表達與風濕性關節炎有關；5b在破骨細胞（osteoclast）中表達、酶切后產生16和25kD多肽片段，不含唾液酸糖基，pH為5.8最佳，為破骨細胞的標志，具有破骨細胞調節中骨再吸收（resorption）活性，用于評價破骨細胞數目，異常表達與骨病，以及抗異化藥物治療（包括二磷酸、雌激素、雌激素受體調節劑等）有關。抗酒石酸酸性磷酸酶在酸性環境下，催化磷酸酯鍵的水解，產生醇和釋放磷酸。基于二氯乙酰苯基磷酸（2,6-dichloro-4-acetylphenyl phosphate），在酒石酸（tartrate）和5a抑制劑肝素（heparin）存在的條件下，通過抗酒石酸酸性磷酸酶5b的催化，產生磷酸（phosphate）和生色產物二氯乙酰苯酚（2,6-dichloro-4-acetylphenol），在分光光度儀下，其吸光值的變化（340nm 波長），來定量測定破骨細胞型抗酒石酸酸性磷酸酶的活性。破骨細胞型抗酒石酸酸性磷酸酶反應系統為：

 

TRACP5b

2,6-dichloro-4-acetylphenyl phosphate  +  H2O      →      Pi  +  2,6-dichloro-4-acetylphenol

             Tartrate/heparin

 

產品內容

 

緩沖液（Reagent A）   8毫升

反應液A（Reagent B） 400微升

反應液B（Reagent C） 400微升

底物液（Reagent D）   2.5毫升

產品說明書      1份

 

保存方式

 

保存在－20℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

恒溫培養箱：用于反應物孵育的容器

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

 

實驗步驟

 

• 測定準備

 

• 準備好待測樣品，置于冰槽里
• 設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長340nm，間隔60秒，讀數6次（共5分鐘），并置零
• 緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

 

• 樣品總活性測定

 

• 移取150微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入20微升反應液A（Reagent B）
• 加入20微升待測樣品（總量50微克蛋白）
• 放進37℃恒溫培養箱孵育5分鐘
• 加入60微升底物液（Reagent D）
• 上下傾倒數次，混勻
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數（5分鐘—0分鐘）

 

• 樣品非特異活性測定

 

• 移取150微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入20微升反應液B（Reagent C）
• 加入20微升待測樣品（總量50微克蛋白）
• 放進37℃恒溫培養箱孵育5分鐘
• 加入60微升底物液（Reagent D）
• 上下傾倒數次，混勻
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數（5分鐘—0分鐘）   

 

• 計算樣品活性

 

[（樣品總活性讀數－樣品非特異活性讀數）X 0.25（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數]÷[0.02（樣品容量；毫升）X 21.49（毫摩爾吸光系數）X 5 （反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾二氯乙酰苯酚/分鐘

 

 

 

五、酶標儀測定

 

• 在96孔板上做好相應標記：樣品總活性和樣品非特異活性
• 分別移取150微升緩沖液（Reagent A）到所有孔里
• 加入20微升反應液A（Reagent B）到樣品總活性孔里
• 加入20微升反應液B（Reagent C）到樣品非特異活性孔里
• 分別加入20微升待測樣品（50微克蛋白）到所有孔里
• 輕輕搖動96孔板
• 放進37℃恒溫培養箱孵育5分鐘
• 分別加入60微升底物液（Reagent D）到所有孔里
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測，獲得吸光讀數（0分鐘和5分鐘讀數）
• 活性計算

 

[（樣品總活性讀數－樣品非特異活性讀數）X樣品稀釋倍數X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.02（樣品容量；毫升）X 21.49（毫摩爾吸光系數）X 5（反應時間；分鐘）X 0.6 （光徑距離；厘米）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾二氯乙酰苯酚/分鐘

 

注意事項

 

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 樣品須澄清，至關重要 
• 避免使用氟化物（fluoride）、草酸鹽（oxalate）、氯苯丁酯（clofibrate）等處理樣品
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測定讀數升高表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 抗酒石酸酸性磷酸酶5b單位活性定義為：在37℃，pH 6.6條件下，每分鐘內能夠釋放1微摩爾二氯乙酰苯酚所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列酸性磷酸酶類檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感

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