組織銅離子濃度比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

組織銅離子濃度比色法定量檢測試劑是一種旨在通過偶氮生色底物，與還原后的一價(jià)銅反應(yīng)產(chǎn)生紫色螯合復(fù)合物，在分光光度儀下通過吸光峰值的變化，即采用比色法來測定樣品中總銅濃度的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種動(dòng)物和人體組織裂解懸液樣品中總銅的濃度檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，檢測敏感。

技術(shù)背景

銅為人體營養(yǎng)中的必需的微量元素。作為輔因子，含銅酶蛋白在鐵和兒茶酚胺（catecholamine）代謝、游離自由基清除、血紅蛋白、彈力纖維和膠原蛋白合成等活動(dòng)中起著重要作用，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化還原狀態(tài)銅在肝臟和血漿中以銅藍(lán)蛋白（caeruloplasmin）形式存在，具有鐵氧化酶抗氧化活性。銅含量過低，會導(dǎo)致智力遲鈍、色素脫失、貧血、張力減退、骨壞血病變化。一旦缺失，將導(dǎo)致心臟病變、骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎、Menkes綜合征、威爾森氏癥等。由此，銅含量檢測成為威爾森氏癥、小細(xì)胞低色素性（microcytic hypochromic anemia）貧血、骨病等的診斷指標(biāo)。銅的檢測包括化學(xué)法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技術(shù)，但容易受到其它金屬元素的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求。4-(3,5-溴基-2-吡啶偶氮基)-5-(N-乙基-N-磺丙基)苯胺（4-(3,5-Bromo-2-pyridylazo) -5-(N-ethyl-N-sulfopropyl)aniline；Di-Br-PAESA）比色法是一種穩(wěn)定、簡便、準(zhǔn)確的銅檢測技術(shù)。在弱酸性條件下，銅從復(fù)合物中解離出來；抗壞血酸（還原型）將解離出來的二價(jià)銅離子還原成一價(jià)銅離子，一價(jià)銅離子與顯色劑 DiBr-PAESA生成紫色絡(luò)合物，在分光光度儀下通過吸光峰值的變化（波長580nm），來定量測定組織銅的總濃度。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

   Copper  +  Di-Br-PAESA   →    blue chelated complex

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）      60毫升

裂解液（Reagent B）      10毫升

去干擾液（Reagent C）  1毫升

緩沖液（Reagent D）      20毫升

還原液（Reagent E）       4瓶

顯色液（Reagent F）       1毫升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）    200微升

產(chǎn)品說明書     1份

保存方式

保存在4℃冰箱里，有效保證3月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

DOUNCE勻漿器：用于組織勻化

微型臺式離心機(jī)：用于樣品制備

比色皿：用于反應(yīng)的容器

分光光度儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣品準(zhǔn)備

• 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個(gè)液氮凍存管
• 即刻放進(jìn)液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的500微升裂解液（Reagent B） 
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約40下）
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 加入50微升抗干擾液（Reagent C）
• 渦旋震蕩10秒
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測樣品，置于冰槽里備用
• 設(shè)定好分光光度儀：波長580nm（570至590nm波長），并置零 
• 實(shí)驗(yàn)開始前，移取5毫升緩沖液（Reagent D）到1瓶還原液（Reagent E）中，混勻后，標(biāo)記為反應(yīng)工作液，置于冰槽里備用，避免光照。

三、比色測定

• 移取1毫升上述配制的反應(yīng)工作液到新的1毫升比色皿
• 加入100微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）或待測樣品
• 加入50微升顯色液（Reagent F）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 37℃室溫下孵育5分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)（OD） 
• 計(jì)算樣品銅濃度

（待測樣品讀數(shù)÷標(biāo)準(zhǔn)樣品讀數(shù)）X 500（標(biāo)準(zhǔn)濃度；微克/分升）＝微克/分升

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)液
• 本產(chǎn)品線性范圍為10微克/分升至1毫克/分升
• 操作時(shí)，須戴手套
• 避免使用EDTA等處理樣本
• 系統(tǒng)操作過程中，標(biāo)準(zhǔn)液測定只需1次
• 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行比色測定，不宜超過2分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 用戶可以換算獲得：微克/毫克組織或蛋白；微摩爾/毫克組織或蛋白
• 微克/分升換算成微摩爾/升：微克/分升 X 0.1573
• 建議用戶建立正常參考值
• 本公司提供系列銅生化檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

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