細胞尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（uPA）活性熒光定量檢測試劑盒

產品說明書（中文版）

主要用途

細胞尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（uPA）活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過三肽化合物底物p-ERG-AMC受到尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的水解，釋放熒光產物7-氨基-4-甲基香豆素，產生熒光峰值的變化，即采用熒光法來測定細胞裂解萃取樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體等）尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（uPA）的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

 

技術背景

 

尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（urokinase-type Plasminogen Activator；uPA；EC3.4.21.73），又稱為尿激酶（urokinase；UK），屬于絲氨酸蛋白酶，存在于血液、細胞外基質和尿液中。尿激酶由411氨基酸構成，分子量為54KD，有3個結構域：絲氨酸蛋白酶結構域、kringle結構域和生長因子結構域。其主要的生理性底物為纖維蛋白溶酶原（Plasminogen），即纖維蛋白溶酶（plasmin）的酶原形式（zymogen），切離部位為Cys-Pro-Gly-Arg⊥Val -Val-Gly-Gly-Cys。一旦切離后激活，纖維蛋白溶酶參與細胞蛋白水解過程，包括血栓溶解（thrombolysis）和細胞外基質降解等。uPA與組織重構、修復、血管形成（angiogenesis）性疾病和腫瘤擴散有關。uPA的抑制劑是絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpins），即纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑（Plasminogen Activator Inhibitor；PAI）。基于人工合成的三肽化合物底物p-EGR-AMC（pyro-Glu-Gly-Arg -7-amino-4-methylcoumarin；焦谷氨酸酰甘氨酰精氨酸氨甲基香豆素）受到尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的水解，釋放熒光產物7-氨基-4-甲基香豆素，在熒光分光光度儀（激發波長360nm，散發波長460nm）下，測定熒光峰值的變化，來定量測定尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的活性。其反應系統為：

 

uPA

p-EGR-AMC       →      p-EGR-OH  +   AMC

                    

產品內容

 

清理液（Reagent A） 120毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

緩沖液（Reagent C） 2.5毫升

底物液（Reagent D）   250微升

標準液（Reagent E）    50微升

產品說明書      1份

 

保存方式

 

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；底物液（Reagent D）和標準液（Reagent E）避免光照和反復凍融；有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品制備和儲存的容器

細胞刮脫棒：用于細胞脫離

微型臺式離心機：用于樣品沉淀

培養箱：用于反應物孵育

黑色96孔板或100微升1厘米光徑比色皿：用于樣品熒光測定的容器

熒光酶標儀或熒光分光光度儀：用于樣品熒光分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的底物液（Reagent D）和標準液（Reagent E）室溫下融化，避免光照。然后進行下列操作。

 

• 樣品制備

 

• 準備好25cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

 

• 測定準備

 

• 準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取液等），置于冰槽里
• 設定好熒光分光光度儀（溫度為37℃）：激發波長360nm，散發波長460nm
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
• 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 分別加入20微升緩沖液（Reagent C）到1至5號管
• 移取20微升標準液（Reagent E）到1號管，混勻
• 小心移取20微升1號管稀釋的標準液（Reagent E）到2號管，混勻
• 小心移取20微升2號管稀釋的標準液（Reagent E）到3號管，混勻
• 小心移取20微升3號管稀釋的標準液（Reagent E）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

 

管號	緩沖液（Reagent C）	標準液（Reagent E）	測定體系 標準氨甲基香豆素濃度
1	20微升	20微升	10微爾/升
2	20微升	20微升1號管	5微摩爾/升
3	20微升	20微升2號管	2.5微摩爾/升
4	20微升	20微升3號管	1.25微摩爾/升
5	20微升	0	0

 

• 標準曲線測定

 

• 在黑色96孔板上做好相應標記：標準樣品1至5號
• 分別移取80微升緩沖液（Reagent C）到所有孔里
• 分別加入10微升上述配制的標準液（Reagent E）到相應孔里 
• 分別加入10微升底物液（Reagent D）到所有孔里
• 輕輕搖動黑色96孔板（注意：避免氣泡）
• 在37℃溫度下孵育10分鐘 
• 即刻放進熒光分光光度儀檢測：獲得相對熒光讀數（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 重復實驗步驟1至7四次
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為相對熒光單位（RFU）；橫座標（X軸）為標準氨甲基香豆素濃度（微摩爾/升）

 

• 樣品活性測定

 

• 移取85微升緩沖液（Reagent C）到相應孔里
• 加入10微升上述制備的待測樣品（50微克蛋白）到相應孔里（注意：樣品須清澈）
• 加入10微升底物液（Reagent D）
• 輕輕搖動黑色96孔板（注意：避免氣泡）
• 在37℃溫度下孵育10分鐘 
• 即刻放進熒光分光光度儀檢測：獲得樣品相對熒光讀數（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 根據標準曲線獲得樣品對應氨甲基香豆素濃度（微摩爾/升）

 

• 計算樣品實際活性

 

[根據標準曲線獲得樣品對應氨甲基香豆素濃度（微摩爾/升）X 0.1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數]÷ [0.01（樣品容量；毫升）X 10（反應時間；分鐘）＝納摩爾/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝納摩爾/毫克/分鐘

 

注意事項

 

• 本產品為25次操作，包括標準測定
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，標準測定只需1次
• 樣品須澄清，且避免反復凍融
• 測定值由低到高變化
• 孵育反應完成后即刻進行熒光測定
• 如果酶活性過低，可以增加反應時間至30分鐘
• 樣本測定10分鐘讀數高于0分鐘讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/10微升（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑單位活性定義為：在37℃，pH 7..5條件下，每分鐘內能夠切離1微摩爾三肽化合物底物p-ERG-AMC所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列細胞蛋白酶學檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感

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