細胞脂蛋白脂酶活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

細胞脂蛋白脂酶（LPL）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過脂蛋白脂酶反應系統中對硝基酚丁酸水解后產物峰值的變化，即采用比色法來測定細胞裂解萃取樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解樣品（動物、人體、昆蟲等）脂蛋白脂酶的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

 

技術背景

 

脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase；LPL或LIPD；EC3.1.1.34），是脂蛋白代謝中酶之一，催化脂蛋白上的脂質水解為3個游離脂肪酸和1個甘油分子。其在心臟、肌肉和脂肪組織中表達。尤其在毛細管的內皮細胞中特異性存在。脂蛋白脂酶有不同組織特異性同工酶：肝臟、胰臟、溶酶體等，均由同源雙體構成，具有甘油三酯水解酶和攝入脂蛋白配體/搭橋因子的雙重作用。脂蛋白脂酶缺失將導致I型高脂蛋白血癥（type I Hyperlipoproteinemia）。胰島素可以激活脂蛋白脂酶。基于對硝基酚丁酸（p-nitrophenol butyrate）在脂蛋白脂酶的催化下，產生丁酸（butyrate）和生色產物對硝基苯酚（p-nitrophenol），在分光光度儀下，其吸光值的變化（400nm 波長），來定量測定脂蛋白脂酶的活性。脂蛋白脂酶反應系統為：

 

lipoprotein lipase

p-nitrophenol butyrate  +  H2O      →      butyrate  +  p-nitrophenol

           

產品內容

 

清理液（Reagent A） 120毫升

裂解液（Reagent B）    10毫升

緩沖液（Reagent C）  20毫升

底物液（Reagent D） 500微升

陰性液（Reagent E）     1毫升

產品說明書      1份

 

保存方式

 

保存裂解液（Reagent B）和底物液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，底物液（Reagent D）避免光照，有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細胞刮脫棒：用于細胞脫離

（微型）臺式離心機：用于樣品制備

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

 

實驗步驟

 

• 樣品準備

 

• 準備好25cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

 

• 測定準備

 

• 準備好待測樣品（例如細胞裂解樣品等），置于冰槽里
• 設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長400nm，間隔60秒，讀數6次（共5分鐘），并置零 
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

• 背景對照測定

 

• 移取880微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入20微升底物液（Reagent D）
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入100微升陰性液（Reagent E）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（5分鐘讀數－0分鐘讀數） 

 

• 樣品測定

 

• 移取880微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入20微升底物液（Reagent D）
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入100微升待測樣品（20微克蛋白）（注意：樣品須清澈，且pH為7.2）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（5分鐘讀數－0分鐘讀數） 

 

• 計算樣品活性

 

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 1.0（體系容量；毫升）]÷[0.1（樣品容量；毫升）X 5（反應時間；分鐘）X 14.8（毫摩爾吸光系數）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾對硝基苯酚/分鐘

 

六、酶標儀測定

 

• 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取220微升緩沖液（Reagent C）到相應孔里
• 分別加入5微升底物液（Reagent E）
• 輕輕搖動96孔板
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入25微升陰性液（Reagent F）或待測樣品（20微克蛋白）（注意：樣品須清澈，且pH為7.2）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測，包括（0分鐘初始讀數和5分鐘讀數）
• 活性計算

 

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.025（樣品容量；毫升）X 14.8（毫摩爾吸光系數）X 5（反應時間；分鐘）X 0.6（光徑距離；厘米）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾對硝基苯酚/分鐘

 

注意事項

 

• 本產品為20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，至關重要
• 加樣后3秒內比色測定
• 測定值由低到高變化；測定可持續5分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測定5分鐘讀數高于0分鐘讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為20微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高，即5分鐘讀數不變或為零，則可以增加或降低樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 脂蛋白脂酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.2條件下，每分鐘內能夠釋放1微摩爾對硝基苯酚所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列細胞脂類酶學檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感

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