線粒體呼吸鏈復合物I活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

線粒體呼吸鏈復合物I（NADH－輔酶Q還原酶）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在使用合成輔酶Q同功類似物和特異性抑制劑，通過反應系統測定樣品中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后峰值的降低，即采用比色法測定樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種純化線粒體樣品（動物、人體、酵母）以及細胞或組織裂解懸液樣品的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）－輔酶Q還原酶的特異性活性檢測。其用于衰老、能量代謝、蛋白組學、病理生理學、神經病變等研究。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，反應優化，檢測敏感。

 

技術背景

 

線粒體呼吸鏈復合物I，通常稱為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶Q還原酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide coenzyme Q reductase；NADH-CoQ reductase），又稱為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase；NADH dehydrogenase），是線粒體電子傳遞鏈中最大的結構成分：含有30至40多個多肽結構。其特征性的酶活性是魚藤酮敏感的NADH－輔酶Q還原酶（NADH:Q Reductase）。復合物I催化線粒體內電子由供體NADH傳遞到內膜上輔酶Q受體（泛醌；ubiquinone）的能量轉移反應，為整個呼吸鏈反應系統的第一步�；�于輔酶Q底物，在魚藤酮存在與否的情況下，通過NADH－輔酶Q還原酶的催化，轉化成還原型泛醌（CoQH2），同時還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），在分光光度儀下產生吸收峰值的變化（340nm 波長），由此定量測定NADH－輔酶Q還原酶的特異活性。其反應系統是：

 

NADH:Q Reductase 

NADH  + H^＋ +  CoQ       →      NAD^－  +  CoQH2

     

產品內容

 

緩沖液（Reagent A）  20毫升

反應液（Reagent B）  2.5毫升

陰性液（Reagent C）     2毫升

底物液（Reagent D） 500微升

專性液（Reagent E）   200微升

產品說明書      1份

 

保存方式

 

保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；反應液（Reagent B）含有毒性物質，避免直接用手接觸；反應液（Reagent B）和底物液（Reagent D），避免光照，有效保證6月

 

用戶自備

 

比色皿：用于比色分析的容器

雙波長分光光度儀：用于比色分析

培養箱：用于孵育反應物

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；緩沖液（Reagent A）室溫預熱；反應液（Reagent B）和底物液（Reagent D）注意避光。然后進行下列操作。

 

• 測定準備

 

• 準備好待測樣品（例如純化線粒體樣品等），置于冰槽里 
• 設定好雙波長分光光度儀（溫度為30℃）：波長分別為340nm和380nm，間隔30秒，讀數7次（共3分鐘），并置零 

 

• 背景對照測定

 

• 移取780微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升反應液（Reagent B） 
• 加入20微升底物液（Reagent D）
• 放進30℃培養箱里靜置3分鐘
• 加入100微升陰性液（Reagent C）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：

（340波長讀數－380波長讀數）0分鐘－（340波長讀數－380波長讀數）1分鐘或3分鐘 

 

• 樣品總活性測定

 

• 移取780微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升反應液（Reagent B）
• 加入20微升底物液（Reagent D）
• 放進30℃培養箱里靜置3分鐘
• 加入100微升待測樣品（注意：10微克總線粒體蛋白）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數：

（340波長讀數－380波長讀數）0分鐘－（340波長讀數－380波長讀數）1分鐘或3分鐘

 

• 樣品非特異活性測定

 

• 移取760微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升反應液（Reagent B）
• 加入20微升專性液（Reagent E）
• 加入20微升底物液（Reagent D）
• 放進30℃培養箱里靜置3分鐘
• 加入100微升待測樣品（注意：10微克總線粒體蛋白）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數：

（340波長讀數－380波長讀數）0分鐘－（340波長讀數－380波長讀數）1分鐘或3分鐘 

 

• 計算樣品活性

 

1）樣品活性（總活性或非特異活性）

 

【（樣品讀數－背景讀數）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數】÷【0.1（樣品容量；毫升）X 5.5（毫摩爾吸光系數） X  1或3（反應時間；分鐘）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾NADH/分鐘

 

2）樣品特異活性

 

樣品總活性－樣品非特異活性＝樣品特異活性

 

注意事項

 

• 本產品為21次（10個樣本）操作，包括背景對照測定
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 線粒體樣品檢測前，須溶解；建議凍存融解（－70℃至37℃）循環3次
• 如果增強酶活檢測，建議使用線粒體復合物待測樣品預處理試劑盒－10342
• 加入樣品啟動反應后3秒內即刻比色測定
• 如果樣本存在明顯干擾，可以選擇進行樣本背景對照測定，即不加反應液（Reagent B），加入待測樣品替代陰性液（Reagent C）
• 通常反應1分鐘后比色測定值趨于穩定；測定值由高到低變化；測定可以持續3分鐘
• 測定值由高到低變化，即3分鐘測定讀數低于0分鐘測定讀數，表明有酶活性
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 96孔板測定初始讀數（0分鐘讀數）0.5左右為理想狀態；比色皿測定為1.0左右
• 如果用戶沒有雙波長同步測定分光光度儀，可以使用單波長340nm替代，注意活性計算時，毫摩爾吸光系數變成6.2
• 建議待測樣本線粒體蛋白濃度為10微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調整（本公司提供線粒體溶解試劑盒10018為后續的線粒體蛋白濃度測定的預處理試劑盒和 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果使用細胞或組織裂解懸液，則蛋白濃度為50微克/100微升
• 樣品特異活性是指魚藤酮敏感的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸－輔酶Q還原酶，去除其它干擾因素（例如復合物II/III/IV等）
• 如果用戶需要研究線粒體呼吸鏈復合物I總活性包括魚藤酮敏感和抗性之和，請咨詢技術顧問，另購補充反應液（Reagent B+）
• 線粒體呼吸鏈復合物I（NADH－輔酶Q還原酶）單位活性定義為：在30℃，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列線粒體及其酶類技術產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測準確

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