細胞衰老特異性脂褐素靛酚原位染色試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

細胞衰老特異性脂褐素靛酚原位染色試劑是一種旨在使用標準化的化學固著方法和非離子化染料靛酚溶解氧化技術，分析培養細胞樣品中脂褐素沉積現象，從而在光學顯微鏡下觀察到紅色表達的細胞作為細胞復制性衰老（replicative senescence）的分子特征來識別和探測衰老細胞的權威而經典的技術方法。該技術經過精心改良、成功實驗證明的。主要適用于各種人體和動物細胞的脂褐素檢測。廣泛應用于細胞生物學研究。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，顯色清晰。  

技術背景

細胞復制性衰老是細胞控制其生長潛能的保障機制。衰老細胞停滯在細胞周期的G1期，表現出細胞扁平、脹大、顆粒增多的形態特征，其中脂褐素顆粒聚集增多成為細胞衰老的特征性生物學標記。脂褐素（lipofusin），又稱為“磨損（wear and tear）”色素，是一種細胞內與年齡相關的熒光胞漿顆粒色素，主要在有絲分裂后細胞的繼發性溶酶體內。脂褐素常見于老年人的永恒性非分裂性組織細胞里，例如心臟、肝臟和神經等，尤其在衰老誘導的細胞退變中聚集增多，特別是萎縮的組織。脂褐素來自于氧化的蛋白和脂質，成為細胞衰老中后期的獨立指征。染料二氯酚靛酚（2,6-Dichlorobenzenone-indophenol或2,6-Dichlorophenolindophenol）經過酸化處理還原且非離子化，具有脂溶性，特異性染色細胞中的脂褐素，除人體心肌組織和小鼠腦組織外。同時使紅細胞呈現藍色。

產品內容

清理液（Reagent A）  120毫升

固著液（Reagent B）   10毫升

染色液（Reagent C）   10毫升

產品說明書           1份

保存方式

保存染色液（Reagent C）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里； 染色液（Reagent C）避免光照；有效保證6月

用戶自備

小型染色缸：用于細胞染色操作

光學顯微鏡：用于觀察染色后的細胞

實驗步驟

操作一：細胞載玻片染色

• 取出待測的細胞載玻片或細胞涂片 
• 小心加上200微升清理液（Reagent A）在載玻片上，鋪滿整個樣品表面
• 小心移去載玻片上的清理液（Reagent A）
• 小心加上200微升固著液（Reagent B）在載玻片上，鋪滿整個樣品表面
• 在室溫下孵育1小時
• 小心移去載玻片上的固著液（Reagent B）
• 小心加上200微升清理液（Reagent A），清洗樣品表面
• 在室溫下孵育5分鐘
• 小心移去載玻片上的清理液（Reagent A）
• 小心加上200微升染色液（Reagent C），鋪滿整個載玻片樣品表面
• 室溫下孵育5分鐘；或直至可見紅色，避免光照
• 小心移去載玻片上的染色液（Reagent C）
• 室溫下，小心將切片置入50毫升清理液（Reagent A）中5次（2秒/次）（注意：參見注意事項7）
• 輕輕移去切片上的清理液（Reagent A） 
• 放上蓋玻片或封片（水相或中性樹脂）（注意：參見注意事項8）
• 即刻在一般光學顯微鏡下觀察：

脂褐素陽性細胞呈現紅色

非脂褐素細胞呈現無色、藍色或淡粉紅色

紅細胞呈現藍色

操作二：24孔細胞培養板染色

• 小心抽去24孔細胞培養板里的培養液
• 每孔加入400微升清理液（Reagent A），清洗生長中的細胞表面
• 小心抽去每孔里的清理液（Reagent A）
• 每孔加入400微升固著液（Reagent B），覆蓋整個生長表面
• 在室溫下孵育1小時
• 小心抽去每孔里的固著液（Reagent B）
• 每孔加入400微升清理液（Reagent A），清洗細胞表面
• 在室溫下孵育5分鐘
• 小心抽去清理液（Reagent A）
• 每孔加入400微升染色液（Reagent C），覆蓋整個生長表面
• 室溫下孵育5分鐘；或直至可見紅色，避免光照
• 小心抽去染色液（Reagent C）
• 小心加入400微升清理液（Reagent A）
• 室溫下孵育2分鐘
• 小心抽去清理液（Reagent A）
• 小心加入200微升清理液（Reagent A）
• 即刻在一般光學顯微鏡下觀察：

脂褐素陽性細胞呈現紅色

非脂褐素細胞呈現無色、藍色或淡粉紅色

紅細胞呈現藍色

注意事項

• 本產品為50次（細胞載玻片）和25次（1個24孔板）操作
• 本產品適合于含有紅細胞的樣本
• 操作時，須戴手套
• 使用時，避免污染母液
• 染色液（Reagent C）避免光照；由于溶液較酸，操作時注意安全
• 試劑溶液在樣品表面時，避免有氣泡存在，同時確保鋪滿樣品表面
• 染色后可以使用清理液（Reagent A）清洗，但不宜過久，否則容易褪色
• 載玻片制片處理忌用極性脂類溶劑，例如乙醇等，否則會去除色素
• 染色完成后，即刻進行光學顯微鏡觀察
• 染色完成后，即刻進行光學顯微鏡觀察，放置過久，染色會出現褪色
• 本公司提供系列細胞衰老分析試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定著色清晰 

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