細(xì)胞谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活性酶偶聯(lián)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

細(xì)胞谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活性酶偶聯(lián)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑是一種旨在通過谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶的酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光譜法來測定細(xì)胞裂解樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種動物細(xì)胞裂解懸液樣品谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶的總活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase；GPT；EC2.6.1.2），又稱為丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Alanine transaminase；ALT或alanine aminotransferase；ALAT），存在于各種人體組織和血液中。谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶催化丙氨酸的氨基轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸（α- Ketoglutarate）的反應(yīng)，產(chǎn)生丙酮酸和谷氨酸。檢測谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶活性，常用于評價肝功能：GPT活性異常與病毒性肝炎、充血性心衰、肝損傷、膽道疾病、傳染性單核細(xì)胞癥有關(guān)。基于底物丙氨酸（L-alanine）和α-酮戊二酸，在谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶的催化作用下，轉(zhuǎn)化成丙酮酸后，通過乳酸脫氫酶系統(tǒng)，測定還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）的吸光峰值變化（340nm 波長），來定量分析谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

 

Alanine aminotransferase/glutamate pyruvate transaminase

α-Ketoglutarate  +  L-alanine       →      pyruvate  +  L-glutamate

         

Lactate dehydrogenase

Pyruvate  +  NADH       →      Lactate  +  NAD⁺   +  H⁺

        （高吸收峰）    （低吸收峰）

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A） 120毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

緩沖液（Reagent C）  20毫升

反應(yīng)液（Reagent D）   2毫升

底物液（Reagent E）     2毫升

陰性液（Reagent F）   500微升

產(chǎn)品說明書      1份

 

 

 

 

保存方式

 

保存裂解液（Reagent B）、反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離

（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品操作

比色皿或96孔板：用于光譜分析的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于光譜分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

• 樣品準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

• 測定準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好待測樣品（例如細(xì)胞裂解萃取懸液樣品等），置于冰槽里
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長340nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零
• 測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）置入冰槽里融化。緩沖液（Reagent A）在30℃溫度下均衡溫度

 

 

• 背景對照測定

 

• 移取750微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入100微升底物液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升陰性液（Reagent F）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照（0分鐘讀數(shù)－5分鐘讀數(shù)）

 

• 樣品測定

 

• 移取750微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入100微升底物液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入50微升待測樣品（50微克細(xì)胞裂解懸液總蛋白）（注意：樣品須清澈，且pH為7.5）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)－5分鐘讀數(shù)） 

 

五、計算樣品活性

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 5（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾NADH/分鐘

 

• 酶標(biāo)儀測定

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品
• 分別移取190微升緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里
• 分別加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 分別加入25微升底物液（Reagent E）
• 輕輕搖動96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入10微升陰性液（Reagent F）或待測樣品（20微克細(xì)胞裂解懸液總蛋白）（注意：樣品須清澈，且pH為7.5）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測，包括（0分鐘初始讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)）
• 活性計算

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.010（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（光徑距離；厘米）X 5（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾NADH/分鐘

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 建議使用比色皿測定
• 加樣后3秒內(nèi)光譜測定
• 測定值由高到低變化；測定可持續(xù)5分鐘
• 光譜測定后，比色皿須清洗徹底
• 背景空對照0分鐘讀數(shù)通常0.5為理想狀態(tài)
• 背景空對照的正常讀數(shù)差值（0分鐘－5分鐘）通常為0.001至0.005（正負(fù)即可）
• 樣品0分鐘讀數(shù)通常和背景空對照0分鐘讀數(shù)一致
• 樣本測定5分鐘讀數(shù)低于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶單位活性定義為：在30℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾NADH所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列細(xì)胞酶學(xué)檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

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