破骨細(xì)胞型抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP5b）活性比色法定量檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

破骨細(xì)胞型抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP5b）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過酸性磷酸酶反應(yīng)系統(tǒng)中，在酒石酸（tartrate）和特異性抑制劑存在的條件下，二氯乙酰苯基磷酸水解后產(chǎn)物峰值的變化，即采用比色法來測定樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種動物或人體細(xì)胞和組織裂解萃取液尤其是破骨細(xì)胞，以及血清等樣品中破骨細(xì)胞型抗酒石酸酸性磷酸酶的特異活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase；TRACP），屬于酸性磷酸酶（acid phosphatase；ACP；EC 3.1.3.2）家族中成員，為酒石酸抗性而與其它酸性磷酸酶區(qū)別。其分為5型和非5型酸性磷酸酶，具有分泌性。5型抗酒石酸酸性磷酸酶根據(jù)碳水化合物含量、pH理想條件、特異活性和亞基結(jié)構(gòu)等，又分為5a和5b：5a在在活化的巨噬細(xì)胞和樹狀細(xì)胞（dendritic）中表達(dá)，35kD分子量，含有唾液酸糖基（sialylated），pH5.2最佳，異常表達(dá)與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)；5b在破骨細(xì)胞（osteoclast）中表達(dá)、酶切后產(chǎn)生16和25kD多肽片段，不含唾液酸糖基，pH為5.8最佳，為破骨細(xì)胞的標(biāo)志，具有破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)中骨再吸收（resorption）活性，用于評價(jià)破骨細(xì)胞數(shù)目，異常表達(dá)與骨病，以及抗異化藥物治療（包括二磷酸、雌激素、雌激素受體調(diào)節(jié)劑等）有關(guān)。抗酒石酸酸性磷酸酶在酸性環(huán)境下，催化磷酸酯鍵的水解，產(chǎn)生醇和釋放磷酸。基于二氯乙酰苯基磷酸（2,6-dichloro-4-acetylphenyl phosphate），在酒石酸（tartrate）和5a抑制劑肝素（heparin）存在的條件下，通過抗酒石酸酸性磷酸酶5b的催化，產(chǎn)生磷酸（phosphate）和生色產(chǎn)物二氯乙酰苯酚（2,6-dichloro-4-acetylphenol），在分光光度儀下，其吸光值的變化（340nm 波長），來定量測定破骨細(xì)胞型抗酒石酸酸性磷酸酶的活性。破骨細(xì)胞型抗酒石酸酸性磷酸酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

 

TRACP5b

2,6-dichloro-4-acetylphenyl phosphate  +  H2O      →      Pi  +  2,6-dichloro-4-acetylphenol

             Tartrate/heparin

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

緩沖液（Reagent A）   8毫升

反應(yīng)液A（Reagent B） 400微升

反應(yīng)液B（Reagent C） 400微升

底物液（Reagent D）   2.5毫升

產(chǎn)品說明書      1份

 

保存方式

 

保存在－20℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

恒溫培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育的容器

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

• 測定準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好待測樣品，置于冰槽里
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長340nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零
• 緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

 

• 樣品總活性測定

 

• 移取150微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入20微升反應(yīng)液A（Reagent B）
• 加入20微升待測樣品（總量50微克蛋白）
• 放進(jìn)37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育5分鐘
• 加入60微升底物液（Reagent D）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)（5分鐘—0分鐘）

 

• 樣品非特異活性測定

 

• 移取150微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入20微升反應(yīng)液B（Reagent C）
• 加入20微升待測樣品（總量50微克蛋白）
• 放進(jìn)37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育5分鐘
• 加入60微升底物液（Reagent D）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數(shù)（5分鐘—0分鐘）   

 

• 計(jì)算樣品活性

 

[（樣品總活性讀數(shù)－樣品非特異活性讀數(shù)）X 0.25（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.02（樣品容量；毫升）X 21.49（毫摩爾吸光系數(shù)）X 5 （反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾二氯乙酰苯酚/分鐘

 

 

 

五、酶標(biāo)儀測定

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：樣品總活性和樣品非特異活性
• 分別移取150微升緩沖液（Reagent A）到所有孔里
• 加入20微升反應(yīng)液A（Reagent B）到樣品總活性孔里
• 加入20微升反應(yīng)液B（Reagent C）到樣品非特異活性孔里
• 分別加入20微升待測樣品（50微克蛋白）到所有孔里
• 輕輕搖動96孔板
• 放進(jìn)37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育5分鐘
• 分別加入60微升底物液（Reagent D）到所有孔里
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測，獲得吸光讀數(shù)（0分鐘和5分鐘讀數(shù)）
• 活性計(jì)算

 

[（樣品總活性讀數(shù)－樣品非特異活性讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.02（樣品容量；毫升）X 21.49（毫摩爾吸光系數(shù)）X 5（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）X 0.6 （光徑距離；厘米）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾二氯乙酰苯酚/分鐘

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 避免使用氟化物（fluoride）、草酸鹽（oxalate）、氯苯丁酯（clofibrate）等處理樣品
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測定讀數(shù)升高表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 抗酒石酸酸性磷酸酶5b單位活性定義為：在37℃，pH 6.6條件下，每分鐘內(nèi)能夠釋放1微摩爾二氯乙酰苯酚所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列酸性磷酸酶類檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

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