細(xì)胞尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（uPA）活性熒光定量檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

細(xì)胞尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（uPA）活性熒光定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)三肽化合物底物p-ERG-AMC受到尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的水解，釋放熒光產(chǎn)物7-氨基-4-甲基香豆素，產(chǎn)生熒光峰值的變化，即采用熒光法來(lái)測(cè)定細(xì)胞裂解萃取樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體等）尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（uPA）的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑（urokinase-type Plasminogen Activator；uPA；EC3.4.21.73），又稱(chēng)為尿激酶（urokinase；UK），屬于絲氨酸蛋白酶，存在于血液、細(xì)胞外基質(zhì)和尿液中。尿激酶由411氨基酸構(gòu)成，分子量為54KD，有3個(gè)結(jié)構(gòu)域：絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域、kringle結(jié)構(gòu)域和生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域。其主要的生理性底物為纖維蛋白溶酶原（Plasminogen），即纖維蛋白溶酶（plasmin）的酶原形式（zymogen），切離部位為Cys-Pro-Gly-Arg⊥Val -Val-Gly-Gly-Cys。一旦切離后激活，纖維蛋白溶酶參與細(xì)胞蛋白水解過(guò)程，包括血栓溶解（thrombolysis）和細(xì)胞外基質(zhì)降解等。uPA與組織重構(gòu)、修復(fù)、血管形成（angiogenesis）性疾病和腫瘤擴(kuò)散有關(guān)。uPA的抑制劑是絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpins），即纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑（Plasminogen Activator Inhibitor；PAI）。基于人工合成的三肽化合物底物p-EGR-AMC（pyro-Glu-Gly-Arg -7-amino-4-methylcoumarin；焦谷氨酸酰甘氨酰精氨酸氨甲基香豆素）受到尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的水解，釋放熒光產(chǎn)物7-氨基-4-甲基香豆素，在熒光分光光度儀（激發(fā)波長(zhǎng)360nm，散發(fā)波長(zhǎng)460nm）下，測(cè)定熒光峰值的變化，來(lái)定量測(cè)定尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

 

uPA

p-EGR-AMC       →      p-EGR-OH  +   AMC

                    

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A） 120毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

緩沖液（Reagent C） 2.5毫升

底物液（Reagent D）   250微升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）    50微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)      1份

 

保存方式

 

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；底物液（Reagent D）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

 

用戶(hù)自備

 

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品制備和儲(chǔ)存的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品沉淀

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

黑色96孔板或100微升1厘米光徑比色皿：用于樣品熒光測(cè)定的容器

熒光酶標(biāo)儀或熒光分光光度儀：用于樣品熒光分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的底物液（Reagent D）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）室溫下融化，避免光照。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 樣品制備

 

• 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

• 測(cè)定準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液等），置于冰槽里
• 設(shè)定好熒光分光光度儀（溫度為37℃）：激發(fā)波長(zhǎng)360nm，散發(fā)波長(zhǎng)460nm
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
• 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管
• 分別加入20微升緩沖液（Reagent C）到1至5號(hào)管
• 移取20微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1號(hào)管，混勻
• 小心移取20微升1號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到2號(hào)管，混勻
• 小心移取20微升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到3號(hào)管，混勻
• 小心移取20微升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到4號(hào)管，混勻
• 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見(jiàn)下表

 

管號(hào)	緩沖液（Reagent C）	標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）	測(cè)定體系 標(biāo)準(zhǔn)氨甲基香豆素濃度
1	20微升	20微升	10微爾/升
2	20微升	20微升1號(hào)管	5微摩爾/升
3	20微升	20微升2號(hào)管	2.5微摩爾/升
4	20微升	20微升3號(hào)管	1.25微摩爾/升
5	20微升	0	0

 

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定

 

• 在黑色96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品1至5號(hào)
• 分別移取80微升緩沖液（Reagent C）到所有孔里
• 分別加入10微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到相應(yīng)孔里 
• 分別加入10微升底物液（Reagent D）到所有孔里
• 輕輕搖動(dòng)黑色96孔板（注意：避免氣泡）
• 在37℃溫度下孵育10分鐘 
• 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè)：獲得相對(duì)熒光讀數(shù)（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至7四次
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：縱座標(biāo)（Y軸）為相對(duì)熒光單位（RFU）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)氨甲基香豆素濃度（微摩爾/升）

 

• 樣品活性測(cè)定

 

• 移取85微升緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里
• 加入10微升上述制備的待測(cè)樣品（50微克蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
• 加入10微升底物液（Reagent D）
• 輕輕搖動(dòng)黑色96孔板（注意：避免氣泡）
• 在37℃溫度下孵育10分鐘 
• 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè)：獲得樣品相對(duì)熒光讀數(shù)（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)獲得樣品對(duì)應(yīng)氨甲基香豆素濃度（微摩爾/升）

 

• 計(jì)算樣品實(shí)際活性

 

[根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)獲得樣品對(duì)應(yīng)氨甲基香豆素濃度（微摩爾/升）X 0.1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷ [0.01（樣品容量；毫升）X 10（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）＝納摩爾/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝納摩爾/毫克/分鐘

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為25次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定只需1次
• 樣品須澄清，且避免反復(fù)凍融
• 測(cè)定值由低到高變化
• 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測(cè)定
• 如果酶活性過(guò)低，可以增加反應(yīng)時(shí)間至30分鐘
• 樣本測(cè)定10分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/10微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
• 尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑單位活性定義為：在37℃，pH 7..5條件下，每分鐘內(nèi)能夠切離1微摩爾三肽化合物底物p-ERG-AMC所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列細(xì)胞蛋白酶學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感

上海一基實(shí)業(yè)有限公司多年專(zhuān)供：ELISA試劑盒，PCR恒溫?zé)晒鉁y(cè)試盒、朗道校準(zhǔn)品、校準(zhǔn)質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)品|對(duì)照品、抗體|抗原、生物試劑、動(dòng)物血清、人類(lèi)CDNA、基因組DNA、MicroRNA產(chǎn)品、總RNA產(chǎn)品、人原代細(xì)胞裂解液、生物試劑、高端試劑等系列產(chǎn)品。如需產(chǎn)品詳細(xì)說(shuō)明等物理性質(zhì)信息請(qǐng)聯(lián)系客服為您查詢(xún)！質(zhì)量保證，價(jià)格優(yōu)惠，是國(guó)內(nèi)生物試劑權(quán)威的供應(yīng)商之一，專(zhuān)業(yè)經(jīng)銷(xiāo)生物科學(xué)領(lǐng)域的品牌試劑：Sigma試劑、ASROS試劑、AIFA試劑、alding試劑、Fisher試劑、日本MBL試劑、美國(guó)劍橋CIL氘代試劑、ATCC菌株等品牌產(chǎn)品。擁有齊全的生產(chǎn)和檢測(cè)設(shè)備，實(shí)施嚴(yán)格的管理制度和完善的質(zhì)量保證體系，為廣大客戶(hù)提供全面的技術(shù)支持和完善的售后服務(wù)。歡迎來(lái)電咨詢(xún)!