細(xì)胞脂蛋白脂酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書（中文版）

主要用途

細(xì)胞脂蛋白脂酶（LPL）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)脂蛋白脂酶反應(yīng)系統(tǒng)中對(duì)硝基酚丁酸水解后產(chǎn)物峰值的變化，即采用比色法來(lái)測(cè)定細(xì)胞裂解萃取樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解樣品（動(dòng)物、人體、昆蟲等）脂蛋白脂酶的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase；LPL或LIPD；EC3.1.1.34），是脂蛋白代謝中酶之一，催化脂蛋白上的脂質(zhì)水解為3個(gè)游離脂肪酸和1個(gè)甘油分子。其在心臟、肌肉和脂肪組織中表達(dá)。尤其在毛細(xì)管的內(nèi)皮細(xì)胞中特異性存在。脂蛋白脂酶有不同組織特異性同工酶：肝臟、胰臟、溶酶體等，均由同源雙體構(gòu)成，具有甘油三酯水解酶和攝入脂蛋白配體/搭橋因子的雙重作用。脂蛋白脂酶缺失將導(dǎo)致I型高脂蛋白血癥（type I Hyperlipoproteinemia）。胰島素可以激活脂蛋白脂酶。基于對(duì)硝基酚丁酸（p-nitrophenol butyrate）在脂蛋白脂酶的催化下，產(chǎn)生丁酸（butyrate）和生色產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenol），在分光光度儀下，其吸光值的變化（400nm 波長(zhǎng)），來(lái)定量測(cè)定脂蛋白脂酶的活性。脂蛋白脂酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

 

lipoprotein lipase

p-nitrophenol butyrate  +  H2O      →      butyrate  +  p-nitrophenol

           

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A） 120毫升

裂解液（Reagent B）    10毫升

緩沖液（Reagent C）  20毫升

底物液（Reagent D） 500微升

陰性液（Reagent E）     1毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書      1份

 

保存方式

 

保存裂解液（Reagent B）和底物液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，底物液（Reagent D）避免光照，有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于細(xì)胞脫離

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

• 樣品準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

• 測(cè)定準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解樣品等），置于冰槽里
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)400nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零 
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

• 背景對(duì)照測(cè)定

 

• 移取880微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入20微升底物液（Reagent D）
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入100微升陰性液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)） 

 

• 樣品測(cè)定

 

• 移取880微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入20微升底物液（Reagent D）
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入100微升待測(cè)樣品（20微克蛋白）（注意：樣品須清澈，且pH為7.2）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)） 

 

• 計(jì)算樣品活性

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 1.0（體系容量；毫升）]÷[0.1（樣品容量；毫升）X 5（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）X 14.8（毫摩爾吸光系數(shù)）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾對(duì)硝基苯酚/分鐘

 

六、酶標(biāo)儀測(cè)定

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取220微升緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里
• 分別加入5微升底物液（Reagent E）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入25微升陰性液（Reagent F）或待測(cè)樣品（20微克蛋白）（注意：樣品須清澈，且pH為7.2）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)，包括（0分鐘初始讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)）
• 活性計(jì)算

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.025（樣品容量；毫升）X 14.8（毫摩爾吸光系數(shù)）X 5（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）X 0.6（光徑距離；厘米）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾對(duì)硝基苯酚/分鐘

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 加樣后3秒內(nèi)比色測(cè)定
• 測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定可持續(xù)5分鐘
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測(cè)定5分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為20微克/100微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高，即5分鐘讀數(shù)不變或?yàn)榱悖瑒t可以增加或降低樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
• 脂蛋白脂酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.2條件下，每分鐘內(nèi)能夠釋放1微摩爾對(duì)硝基苯酚所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列細(xì)胞脂類酶學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感

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