免疫熒光細胞流式儀基礎檢測試劑盒（無一抗和二抗）產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

免疫熒光細胞流式儀基礎檢測試劑（無一抗和二抗）是一種旨在使用優(yōu)化基礎條件包括胞膜通透、非特異性封閉等處理，使目標一抗以及熒光染料綴合物二抗的應用效果增強，通過雙重參數(shù)細胞流式儀定量分析細胞樣品中蛋白表達狀況的的權威而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。主要適用于各種活體細胞（動物、人體等）的目標蛋白表達水平的測定。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，反應敏感，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術背景

免疫熒光技術（immunofluorescence）是一種融合免疫學、生物化學和流式細胞儀技術為一體的標記分析技術，通過使用抗體抗原反應和示蹤熒光染料結合，定量分析目標抗原蛋白分子。免疫熒光技術分為直接法和間接法：前者使用示蹤熒光染料直接標記在特定抗體上，直接檢測目標抗原；后者使用第一抗體先于抗原進行免疫反應，然后運用示蹤熒光染料標記的第二抗體與第一抗原抗體復合物反應，又稱為三明治方法，來檢測目標抗原。在去垢劑通透處理后，使抗體容易接觸到胞漿或細胞器的抗原。借助山羊血清和牛血清白蛋白的作用，降低樣品非特異性背景噪雜，顯示反應的特異性。流式細胞術（FLOW CYTOMETRY）是七十年代發(fā)展起來的集計算機、激光、流體力學、細胞化學、細胞免疫學為一體的高科學技術。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）    300毫升

固著液（Reagent B）    100毫升

封阻液（Reagent C）    300毫升

一抗液（Reagent D）      5毫升（自備）

二抗液（Reagent E）      5毫升（自備）

復染液（Reagent F）    25毫升

產(chǎn)品說明書 1份

保存方式

保存固著液（Reagent B）、封阻液（Reagent C）和復染液（Reagent F）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；復染液（Reagent F），避免光照；有效保證6月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細胞脫離

完全細胞培養(yǎng)液（12052）：用于中和胰蛋白酶的處理

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

2毫升離心管：用于細胞染色的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

細胞流式儀：用于細胞熒光分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里試劑盒中的試劑置入冰槽里融化。然后進行下列操作：

• 準備1個6孔細胞培養(yǎng)板的細胞（1 X 10⁶細胞/孔）
• 小心抽去培養(yǎng)液
• 加入2毫升清理液（Reagent A），鋪滿培養(yǎng)孔表面
• 小心抽去清理液（Reagent A）
• 加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱孵育1分鐘
• 加入3毫升用戶自備的完全細胞培養(yǎng)液
• 移取細胞混勻液到15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞由此步驟開始）
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為400g（或1500rpm，例如EPPENDORF 5810R）
• 小心抽去上清液
• 加入2毫升清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• （選擇步驟）細胞計數(shù)
• 轉移到2毫升離心管
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 加入2毫升－20℃預冷的固著液（Reagent B），混勻細胞顆粒群
• 置于冰槽里孵育15分鐘或過夜
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D） 
• 小心抽去上清液
• 加入2毫升清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D） 
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升封阻液（Reagent C），上下抽吸混勻
• 室溫下孵育30分鐘
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 用手指輕彈管底，使細胞顆粒松動
• 加入100微升一抗液（Reagent D），充分混勻
• 室溫下孵育45分鐘
• 加入1毫升封阻液（Reagent C），混勻
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 重復實驗步驟30至32一次
• 用手指輕彈管底，使細胞顆粒松動
• 加入100微升二抗液（Reagent E），充分混勻
• 室溫下孵育45分鐘，避免光照
• 加入1毫升封阻液（Reagent C），混勻
• 渦旋震蕩3秒
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為800g（或3000rpm，例如EPPENDORF 5415D）
• 小心抽去上清液
• 重復實驗步驟37至40二次
•  加入500微升復染液（Reagent F），用槍頭充分混勻
• 移入到細胞流式儀專用測試管（可放進4℃冰箱里待測），避免光照
• 即刻進行細胞流式儀分析：波長488nm氬離子激光器，觀察50000個細胞以上
• 建立地形圖或散點圖以及直方圖分析

注意事項

• 本產(chǎn)品為50次操作量
• 操作時，須戴手套，以防污染
• 孵育時，避免光照
• 用戶注意一抗和二抗的用量，避免過量使用；抗體稀釋建議使用封阻液（Reagent C）
• 建議細胞染色完成后，即刻進行細胞流式儀分析。如果放進4℃冰箱里待測，不要超過3天
• 細胞流式儀分析前，須混勻內(nèi)容物
• 細胞檢測量不得少于10000個
• 建議測試陽性或陰性對照組
• 檢測時，須彌補電子補償，以去除雙重參數(shù)的光譜重疊
• 告知流式儀技術員有關細胞類型
• 本公司提供系列蛋白表達分析試劑產(chǎn)品

質量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰

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