在單細胞RNA測序（scRNA-seq）中，當兩個細胞被捕獲到同一反應液滴時，會形成雙聯(lián)體（doublet）。在后續(xù)分析中會因帶有相同的Barcode，會被認為是一個細胞的偽細胞。這類細胞會對分析產(chǎn)生影響，從而扭曲分析結果。因此，計算doublet檢測方法成為必要工具。

《Benchmarking Computational Doublet-Detection Methods for Single-Cell RNA Sequencing Data》文獻系統(tǒng)性評估了九種主流方法（包括doubletCells、Scrublet、cxds、bcds、hybrid、Solo、DoubletDetection、DoubletFinder和DoubletDecon），使用16個真實數(shù)據(jù)集，并通過scDesign生成的112個合成數(shù)據(jù)集，從檢測的準確性，下游分析的影響，到計算效率等各方面評估。

綜合顯示，DoubletFinder在檢測準確性上表現(xiàn)最佳。

DoubletFinder分析可分為4個步驟：
(1) 利用已有的scRNA-seq數(shù)據(jù)生成doublet；
(2) 對合并的真實人工數(shù)據(jù)進行預處理；
(3) 進行PCA主成分分析，利用PC距離矩陣求出每個細胞的人工k個最近鄰（pANN）的比例；
(4) 根據(jù)預期的doublet數(shù)量排序和計算閾值pANN值。

 
以下是我們分析的示例代碼：

1.讀入單細胞數(shù)據(jù)，并進行一系列預處理（包括單細胞數(shù)據(jù)質控、標準化、降維聚類等）：

seu_kidney <- CreateSeuratObject(kidney.data)

seu_kidney <- NormalizeData(seu_kidney)

seu_kidney <- FindVariableFeatures(seu_kidney, selection.method = "vst", nfeatures = 3000)

seu_kidney <- ScaleData(seu_kidney)

seu_kidney <- RunPCA(seu_kidney)

seu_kidney <- RunUMAP(seu_kidney, dims = 1:20)

選擇統(tǒng)計上顯著的主成分的數(shù)量，下圖為我們選擇的主成分數(shù)量。

 
2. 尋找最優(yōu)pK值：

sweep.res.list_kidney <- paramSweep(seu_kidney, PCs = 1:20, sct = FALSE)

gt.calls <- seu_kidney@meta.data[rownames (sweep.res.list_kidney[[1]]), "GT"]

sweep.stats_kidney <- summarizeSweep(sweep.res.list_kidney, GT = TRUE, GT.calls = gt.calls)

bcmvn_kidney <- find.pK(sweep.stats_kidney)

 
3. 雙細胞比例計算：

homotypic.prop <- modelHomotypic(annotations)

nExp_poi <- round(0.075*nrow(seu_kidney@meta.data))

nExp_poi.adj <- round(nExp_poi*(1-homotypic.prop))

 
4. 鑒定雙細胞：

seu_kidney <- doubletFinder(seu_kidney, PCs = 1:20, pN = 0.25, pK = 0.09, nExp = nExp_poi, reuse.pANN = FALSE, sct = FALSE)

seu_kidney <- doubletFinder(seu_kidney, PCs = 1:20, pN = 0.25, pK = 0.09, nExp = nExp_poi.adj, reuse.pANN = "pANN_0.25_0.09_913", sct = FALSE)

 
5. 確定了Doublet-Low Confidience， Doublet-High Confidience，Singlet三種細胞類型，并進行可視化，包含TSNE和UMAP兩種展示形式：

DimPlot(pbmc, reduction = "tsne", group.by ="DF_hi.lo",cols =c("red","gold","#1bb3b6"),pt.size = 0.8) + ggtitle("DoubletFinder")

DimPlot(pbmc, reduction = "umap", group.by ="DF_hi.lo",cols =c("red","gold","#1bb3b6"),pt.size = 0.8) + ggtitle("DoubletFinder")

 

 
在完成DoubletFinder雙細胞分析之后，我們可以從單細胞數(shù)據(jù)的meta.data表中，查看結果，用于之后的下游分析。

 
以上是對DoubletFinder雙細胞分析方法的展示。雙細胞的去除非常必要，當我們剔除這類潛在的雙細胞數(shù)據(jù)后，后續(xù)的分析結果也就更可靠了。