增強型藍色熒光蛋白EBFP、增強型黃色熒光蛋白EYFP的介紹與應用
自1962年GFP被發現以來，科學家們對熒光蛋白更深入的探索和應用從未停止。通過一系列的探索，各種不同波長的突變體熒光蛋白現世，大大擴充了熒光蛋白的品類，滿足了科學家們在不同課題中的需求，并且在蛋白標記、體內示蹤等方面得到了廣泛應用。
之前我們也介紹過GFP經過改造后產生的不同顏色突變體，如黃色突變體（EYFP）、藍色突變體（EBFP）等。今天，小編就帶大家仔細了解一下這兩種突變體及其他熒光蛋白。
圖1 各色熒光蛋白生物成像圖
1 藍色熒光蛋白
增強型藍色熒光蛋白（EBFP）有四個氨基酸突變，它的激發波長為380nm，發射波長為440nm。突變后的EBFP雖然在蛋白折疊及發色團形成效率方面得到了改善，使其所發出的熒光亮度與BFP相比有所增強。但EBFP的熒光整體仍較弱，與野生型GFP熒光強度相近，成像時背景信號較高。
因此針對其研發出了3個更亮的熒光突變體：Azurite、EBFP2和mTagBFP，它們的亮度分別是EBFP的1.6倍、2倍和3.7倍。其中，mTagBFP是由紅色熒光蛋白TagRFP突變而來的。
圖2 成纖維細胞 （皮膚細胞）用熒光染料標記（圖片來源于包圖網）
2 黃色熒光蛋白
增強型黃色熒光蛋白（EYFP）是最早的黃色熒光蛋白突變體，有四個氨基酸發生突變，使得EYFP的發射光變為黃綠色，且熒光強度與EGFP熒光強度相似。不過EYFP雖已被廣泛應用，但它本身存在一些缺陷導致其并非最理想的熒光蛋白。
目前，mCitrine和mVenus在EYFP基礎上改進的黃色熒光變體應用較為廣泛。另外，還有一種經合成的DNA重排獲得的能量轉移黃色熒光蛋白YPet，亮度在黃色熒光蛋白中是最強的，且光穩定性較強。同時，YPet比mVenus或者其他熒光蛋白對于酸性環境的耐受能力更強。
圖3 紡錘體中 YFP 表達的焦點成像（PLoS One. 2015;10(3):e0119538.）
對于細胞、組織來說，長波長光子的激發產生的光毒性更小，且動物組織光吸收和自體熒光也更小。因此，紅色的熒光基團因其較低的背景可以表現出更高的對比度，更適合于體內成像。這使得熒光蛋白的改造慢慢向紅色偏移。
3 紅色熒光蛋白
紅色熒光蛋白在1999年首次被報道，與綠色熒光蛋白GFP一樣，紅色熒光蛋白（DrFP583）也是從珊瑚蟲中克隆的一種熒光蛋白，在紫外光激發下可發射紅色熒光。
紅色熒光蛋白的激發和發射波長較GFP相比要更長，成像時背景更低，且可與GFP共用，因此有較大應用前景。但由于DrFP583易寡聚化、成熟緩慢等缺陷限制了它的應用。因此通過對它進行改造，得到了寡聚化程度更低、成熟速度更快的突變體DsRed。另外，還有紅色熒光突變體：mCherry、DsRed、tdTomato和mStrawberry等。
-
mCherry具有優異光穩定性，是最通用紅色單體（但融合表達時有較弱的齊聚效應）
-
tdTomato具有mCherry相同的光穩定性，亮度更強，是追蹤表達水平的理想選擇，但為串聯二聚體，可以在融合標簽大小不干擾蛋白質功能的情況下使用
-
mStrawberry是最亮的紅色單體，但光穩定性要弱于mCherry
-
DsRed是細胞毒性最小的RFP
-
mApple在蛋白的融合表達中是mCherry理想的替代物，但其光穩定性要遠弱于mCherry
-
mKate2從參數方面考量是綜合亮度、光穩定性和齊聚性的最佳RFP，但目前報道相對較少
圖4 基于雙同源重組系統的BASCs遺傳譜系示蹤（Nat Genet. 2019;51(4):728-738. ）
南模生物自主研發多種熒光蛋白工具鼠，即在目的基因的特定位置引入報告基因（包括熒光蛋白，如EGFP、mYFP等）或標記基因的小鼠模型（部分小鼠模型見下表），與特定重組酶工具鼠雜交，可以實現在特定細胞類群標記出所需熒光，幫助蛋白標記、譜系示蹤等實驗順利進行。如您有相關需求，歡迎撥打400-728-0660或者關注微信公眾號點擊在線咨詢，我們的專業團隊將竭誠為您服務！
表1：部分熒光蛋白工具鼠
[1] Kremers, G. J., Goedhart, J., van den Heuvel, D. J., Gerritsen, H. C., & Gadella, T. W., Jr (2007). Improved green and blue fluorescent proteins for expression in bacteria and mammalian cells. Biochemistry, 46(12), 3775–3783. https://doi.org/10.1021/bi0622874
[2] Zeini, D., Glover, J. C., Knudsen, K. D., & Nyström, B. (2021). Influence of Lysine and TRITC Conjugation on the Size and Structure of Dextran Nanoconjugates with Potential for Biomolecule Delivery to Neurons. ACS applied bio materials, 4(9), 6832–6842. https://doi.org/10.1021/acsabm.1c00544
[3] Shimozono, S., & Miyawaki, A. (2008). Engineering FRET constructs using CFP and YFP. Methods in cell biology, 85, 381–393. https://doi.org/10.1016/S0091-679X(08)85016-9
[4] Tang, M., Teng, P., Long, Y., Wang, X., Liang, L., Shen, D., Wang, J., & Zheng, H. (2018). Hollow carbon dots labeled with FITC or TRITC for use in fluorescent cellular imaging. Mikrochimica acta, 185(4), 223. https://doi.org/10.1007/s00604-018-2761-2
[5] Smale S. T. (2010). Luciferase assay. Cold Spring Harbor protocols, 2010(5), pdb.prot5421. https://doi.org/10.1101/pdb.prot5421
[6] Li, Y., Sierra, A. M., Ai, H. W., & Campbell, R. E. (2008). Identification of sites within a monomeric red fluorescent protein that tolerate peptide insertion and testing of corresponding circular permutations. Photochemistry and photobiology, 84(1), 111–119. https://doi.org/10.1111/j.1751-1097.2007.00206.x
[7] Chopra, A. (2008). Gaussia princeps luciferase. In Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD). National Center for Biotechnology Information (US).
關于我們
上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，簡稱"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科創板上市高科技生物公司（股票代碼：688265），始終以編輯基因、解碼生命為己任，專注于模式生物領域，打造了以基因修飾動物模型研發為核心，涵蓋多物種模型構建、飼養繁育、表型分析、藥物臨床前評價等多個技術平臺，致力于為全球高校、科研院所、制藥企業等客戶提供全方位、一體化的基因修飾動物模型產品解決方案。
