通過我們的高通量 ORF 克隆服務，Invitrogen 為您提供使用 Gateway® 技術的機會，這是一種基于 λ 噬菌體重組的蛋白質表達和分析通用系統。 Gateway® 技術可在不同載體間轉移 DNA，而不需要費時的亞克隆步驟。 一旦將基因轉入 Gateway® 入門克隆，即可按照需要的轉入方向及閱讀框，將基因便捷地轉移到一個或多個載體中。 提供一個全長 cDNA 序列，我們的科學家將為您擴增開放閱讀框，并繼而將 PCR 產物克隆到 Gateway® 入門載體中。 然后您可將 ORF 轉入任何 Gateway® 表達載體。 在進行基因功能分析時，全長基因的 5´ 和 3´ 非翻譯區會干擾最佳的蛋白質表達，而 ORF 克隆在這種情況下特別有用。
高通量 ORF 克隆服務
- 制備。 我們將會再次查驗用戶所提供的核苷酸序列，以證實其是完整的開放閱讀框 （ORF） 序列。 引物設計位于起始密碼子 (ATG) 和終止密碼子的兩側。 如果是需要形成 C 端融合蛋白，則不加終止密碼子，只擴增開放閱讀框（圖 1）。
- 擴增。 以質粒為模板、PCR時選用低循環數、高保真地擴增所需的 ORF。
- 篩選。 如果沒有合適的質粒作為模板，我們將從 Invitrogen 的全長 cDNA 文庫中進行篩選。
- 克隆。 我們的科學家會將擴增的開放閱讀框克隆到 Gateway® 入門載體，并且將 DNA 轉化到化學感受態 E. coli 中（圖 2）。
- 測序。 5' 和 3' 端都分別進行測序，以證實擴增到的是正確的靶序列并且具有正確的讀碼框。
- 驗證。 篩選具有抗生素抗性的菌落，以確認所得到的是入門克隆。
- 導入。 客戶收到的經證實的入門克隆保存于甘油中。 可將入門克隆轉移到一個或多個 Gateway® 目的載體中，以生成適合在相應表達系統中立即應用的表達克隆
在 Invitrogen™ 全長 cDNA 文庫中表達的典型全長基因。 基因被克隆到 pCMV•Sport 6.1 載體后，其兩側為 attB1 和 attB2 Gateway® 重組位點。 基因由一個開放閱讀框組成，示為起始蛋氨酸 (ATG) 和終止密碼子之間的區域。 開放閱讀框為基因中編碼功能蛋白的部分。 開放閱讀框兩側為 5´ 和 3´ 非翻譯區，其中包含與調控、轉錄和翻譯后修飾之類功能相關的基序。
圖 2. 基于 PCR 的 ORF 克隆
使用包含 attB1 和 attB2 重組位點的基因特異性引物擴增 ORF。 所得的擴增子可在 BP 反應中與 attP 供體載體 (pDONR™) 重組來生成入門克隆。 包含在入門克隆中的 ORF 兩側為 attL 位點，ORF 隨后可與任何 Gateway® 目的載體重組來生成表達克隆，后者繼而可用于功能研究。
