通用型抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

通用型抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過酸性磷酸酶反應(yīng)系統(tǒng)中，在酸性環(huán)境和酒石酸（tartrate）存在的條件下，對硝基酚磷酸水解后產(chǎn)物峰值的變化，即采用比色法來測定樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種動(dòng)物或人體細(xì)胞和組織裂解萃取液，以及血液樣品包括血清等樣品中抗酒石酸酸性磷酸酶的總活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

酸性磷酸酶（acid phosphatase；ACP；EC 3.1.3.2），是一種酸性水解酶（acid hydrolase）和去磷酸化酶，即磷酸單酯酶（phosphomonoesterase），在酸性環(huán)境下，水解磷酸單酯化合物而釋放出無機(jī)磷。正常情況下，位于溶酶體內(nèi)，作為溶酶體的分子標(biāo)記。在動(dòng)物體內(nèi)和植物中普遍存在。酸性磷酸酶按照組織分布、染色體定位、分子量、氨基酸序列、抗性特點(diǎn)等，分成不同的同工酶，其中抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase；TRAP），為酒石酸抗性而與其它酸性磷酸酶區(qū)別。其分為5型和非5型酸性磷酸酶，5型抗酒石酸酸性磷酸酶在破骨細(xì)胞（osteoclast）、活化的巨噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及懷孕期的豬內(nèi)皮層子宮內(nèi)膜（endometrium）高度表達(dá)；而非5型在紅細(xì)胞和血小板中高度表達(dá)。抗酒石酸酸性磷酸酶是一種在哺乳動(dòng)物內(nèi)表達(dá)的糖化單體金屬蛋白酶，970多堿基，320多氨基酸，分子量為35kD。作為破骨細(xì)胞的標(biāo)志，抗酒石酸酸性磷酸酶與破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)的骨再吸收（resorption）活性和骨生成代謝有關(guān)。抗酒石酸酸性磷酸酶是以酶原形式合成，通過蛋白酶裂解和還原后活化。在酸性環(huán)境下，催化磷酸酯鍵的水解，產(chǎn)生醇和釋放磷酸。在網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖（leukaemic reticuloendotheliosis）或毛細(xì)胞性白血病（hairy cell leukaemia）、戈謝病（Gaucher’s disease）、愛茲性腦病（HIV-induced encephalopathy）、骨巨細(xì)胞瘤（osteoclastoma）、骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis）和代謝性骨病等病人體內(nèi)抗酒石酸酸性磷酸酶顯著增高。基于對硝基酚磷酸（p-nitrophenyl phosphate），在酸性環(huán)境和酒石酸（tartrate）存在的條件下，通過抗酒石酸酸性磷酸酶的催化，產(chǎn)生磷酸（phosphate）和生色產(chǎn)物對硝基苯酚（p-nitrophenol），在分光光度儀下，其吸光值的變化（410nm 波長），來定量測定抗酒石酸酸性磷酸酶的總活性。抗酒石酸酸性磷酸酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

 

TRAP

p-nitrophenyl phosphate  +  H2O      →      Pi  +  p-nitrophenol

             tartrate

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

緩沖液（Reagent A）  20毫升

底物液（Reagent B）   2毫升

終止液（Reagent C）   5毫升

陰性液（Reagent D）   500微升

產(chǎn)品說明書      1份

 

保存方式

 

保存底物液（Reagent B）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent B）避免光照；終止液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月

 

用戶自備

 

恒溫培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育的容器

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

• 測定準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好待測樣品，置于冰槽里
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長410nm，并置零 
• 緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

 

• 背景對照測定

 

• 移取680微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升底物液（Reagent B）
• 加入20微升陰性液（Reagent D）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育30分鐘，避免光照
• 加入200微升終止液（Reagent C），混勻
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照讀數(shù)

 

• 樣品活性測定

 

• 移取680微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升底物液（Reagent B）
• 加入20微升待測樣品（總量50微克蛋白）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育30分鐘，避免光照
• 加入200微升終止液（Reagent C），混勻
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)   

 

• 計(jì)算樣品活性

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.02（樣品容量；毫升）X 18.3（毫摩爾吸光系數(shù)）X 30 （反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾對硝基苯酚/分鐘

五、酶標(biāo)儀測定

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和待測樣品 
• 分別移取175微升緩沖液（Reagent A）到所有孔里
• 分別加入20微升底物液（Reagent B）
• 分別加入5微升陰性液（Reagent D）或待測樣品（20微克蛋白）到相應(yīng)孔里
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 放進(jìn)37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育30分鐘，避免光照
• 加入50微升終止液（Reagent C）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測
• 活性計(jì)算

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 18.3（毫摩爾吸光系數(shù)）X 30（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）X 0.6 （光徑距離；厘米）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾對硝基苯酚/分鐘

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景對照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 終止液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 避免使用氟化物（fluoride）、草酸鹽（oxalate）、氯苯丁酯（clofibrate）等處理樣品
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測定讀數(shù)升高表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 抗酒石酸酸性磷酸酶單位活性定義為：在37℃，pH 4.8條件下，每分鐘內(nèi)能夠釋放1微摩爾對硝基苯酚所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列酸性磷酸酶類檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

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