細胞總脂肪酶（lipase）活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

細胞總脂肪酶（lipase）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過底物三丁酸二巰基丙醇受到脂肪酶水解，釋放出巰基基團，使用Ellman試劑，產生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產物吸光峰值的變化，即采用比色法來測定樣品中酶活性的權威而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心改良、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解樣品（動物、人體、植物、昆蟲等）脂肪酶的總活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

 

技術背景

 

脂肪酶（lipase；EC3.1.1.3）是可溶性糖蛋白分子，催化不溶性脂質分子的酯鍵（ester bond）的水解。在人體中，其來源于胰腺產生。在消化系統(tǒng)中，脂肪酶（Lipase），裂解脂肪分子，例如甘油三酯（triglyceride；TAG），產生1個分子甘油（glycerol）和3個分子游離脂肪酸分子（fatty acid）。脂肪酶異常增高與胰腺炎、胰腺管阻塞、胰腺癌、腎病、唾液腺炎癥、腸道阻塞等相關；異常降低則與胰腺中脂肪酶產生細胞的永久性損傷有關。脂肪酶的活性檢測是臨床診斷的指標之一。基于脂肪酶在水分子的參與下，催化三丁酸二巰基丙醇（dimercaptopropanol tributyrate；DMPTB或BALB）的水解，產生二巰基丙醇（dimercaptopropanol；DMP），并釋放出巰基基團（－SH），進而與Ellman試劑5,5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應后，產生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過其吸收峰值的變化（412nm波長），來定量分析脂肪酶的活性。脂肪酶反應系統(tǒng)為：

lipase

DMPTB  +  H2O  →  DMP  +  TB

 

DTNB  +  DMP -SH  →   TNB  +  DMP -S-S-TNB

 

產品內容

 

清理液（Reagent A）     120毫升

裂解液（Reagent B）   10毫升

緩沖液（Reagent C） 10毫升

反應液（Reagent D）  1毫升

底色液（Reagent E）     500微升

補充液（Reagent F）     500微升

產品說明書      1份

 

保存方式

 

保存反應液（Reagent D）和底色液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底色液（Reagent E）避免光照，有效保證6月

 

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

細胞刮脫棒：用于脫離鐵壁細胞

DOUNCE勻漿器：用于組織裂解

微型臺式離心機：用于樣品制備

恒溫水槽：用于孵育反應

比色皿或96孔板：用于反應和比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

 

實驗步驟

 

• 樣品準備

 

• 準備好25cm²細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群
• 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約80下）
• 將所有細胞勻漿物移入1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

• 測定準備

 

• 準備好待測樣品，置于冰槽里
• 設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長412nm，間隔10分鐘，讀數(shù)4次（共30分鐘），并置零 
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

三、背景對照測定

 

• 移取910微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入40微升底色液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入50微升待測樣品（或100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（30分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

 

• 樣品測定

 

• 移取810微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升反應液（Reagent D）
• 加入40微升底色液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入50微升待測樣品（或100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（30分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

 

• 計算樣品活性

  

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 1（體系容量；毫升）]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 13.6（毫摩爾吸光系數(shù)）X 30（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾DMPTB/分鐘

 

六、酶標儀測定

 

• 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取205微升緩沖液（Reagent C）到所有孔里
• 加入25微升反應液（Reagent D）到樣品孔里
• 加入25微升陰性液（Reagent F）到背景對照孔里
• 分別加入10微升底色液（Reagent E）到所有孔里
• 輕輕搖動96孔板
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入10微升待測樣品（或20微克蛋白）到所有孔里（注意：樣品須清澈，且pH為7.2）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測，包括（0分鐘初始讀數(shù)和30分鐘讀數(shù)）
• 活性計算

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 13.6（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（光徑距離；厘米）X 30（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾DMPTB/分鐘

 

 

 

注意事項

 

• 本產品為20次（96孔板，包括20次樣品和20次背景對照）和5次（比色皿，包括5次樣品和5次背景對照）操作
• 本產品檢測范圍是40至1600毫單位/毫升
• 操作時，須戴手套
• 每次樣品測定，需要背景測定一次
• 樣品須澄清，至關重要
• 樣品中避免含有EDTA、TWEEN20、NP40、巰基乙醇、DTT等，否則干擾檢測
• 孵育反應完成后即刻進行比色測定
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 建議待測樣本的蛋白濃度為100微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 脂肪酶活性單位濃度定義：在37℃下，pH 7.5的情況下，每單位酶在單位時間內（每分鐘）水解1微摩爾三丁酸二巰基丙醇
• 本公司提供系列醫(yī)學生化檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產品經(jīng)鑒定檢測敏感

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