真菌/酵母ATP生物發(fā)光法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

真菌/酵母ATP生物發(fā)光法定量檢測試劑是一種旨在通過螢火蟲熒光素酶反應(yīng)系統(tǒng)，熒光素在酶的催化下，與ATP發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生生物光能，采用冷光儀測定其相對(duì)冷光單位的變化，來定量分析真菌/酵母樣品中ATP濃度的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種真菌/酵母的ATP檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

 

技術(shù)背景

 

三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate；ATP）存在于所有代謝活躍的細(xì)胞內(nèi)，是細(xì)胞活力的標(biāo)志。一旦細(xì)胞死亡，ATP濃度急遽下降。螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）是62 kd 的單體蛋白，催化ATP依賴性熒光素（luciferin）的氧化，經(jīng)過電子轉(zhuǎn)移，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為氧化型熒光素（oxyluciferin）的光能，與ATP量成線性正相關(guān)，通過冷光儀（560nm）檢測，由此定量ATP濃度。其反應(yīng)方式為：

 

luciferase

ATP  +  D-Luciferin ＋ O2   →  Oxyluciferin  +  AMP ＋ PPi ＋ CO2 ＋ Light

            Mg²⁺

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

裂解液（Reagent A）  15毫升

強(qiáng)化液（Reagent B）   5毫升

緩沖液（Reagent C）  2.5毫升

反應(yīng)液（Reagent D）  250微升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）  50微升

產(chǎn)品說明書      1份

 

保存方式

 

保存在－20℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent D）嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品保存和標(biāo)準(zhǔn)液配制的容器

黑色96孔板：用于冷光檢測操作的容器

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品沉淀

平式搖蕩儀：用于混勻孵育反應(yīng)

冷光儀：用于樣品冷光檢測

 

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開始前，從－20℃冰箱里取出試劑，置于室溫下預(yù)熱15分鐘，避免光照；設(shè)置好冷光儀：溫度25℃，1秒延時(shí)（Delay），1秒整合（Integration）檢測。同時(shí)關(guān)上操作室的燈光。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 待測樣品準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好10毫升待測的新鮮真菌/酵母細(xì)胞（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細(xì)胞/毫升）
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 加入250微升裂解液（Reagent A），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 加入100微升強(qiáng)化液（Reagent B）
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里1分鐘
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟8至9五次
• 加入250微升裂解液（Reagent A），充分混勻
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• （選擇步驟）移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

• 標(biāo)準(zhǔn)樣品準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好5個(gè)無菌的1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管
• 按下表分別加入適量的裂解液（Reagent A）到每個(gè)離心管
• 移取5微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1號(hào)管，混勻
• 小心移取10微升1號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到2號(hào)管，混勻
• 小心移取5微升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到3號(hào)管，混勻
• 小心移取5微升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到4號(hào)管，混勻
• 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

 

管號(hào)	裂解液（Reagent A）	標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）	標(biāo)準(zhǔn)ATP濃度
1	500微升	5微升	10－4摩爾/升
2	90微升	10微升1號(hào)管	10－5摩爾/升
3	500微升	5微升2號(hào)管	10－7摩爾/升
4	500微升	5微升3號(hào)管	10－9摩爾/升
5	100微升	空對(duì)照	0

 

• 活性測定

 

測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的緩沖液（Reagent C）置入冰槽里融化，然后移出500微升到新的1.5毫升離心管，加入50微升反應(yīng)液（Reagent D），輕柔混勻后，置于冰槽里，標(biāo)記為反應(yīng)工作液，放在暗室冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 準(zhǔn)備1個(gè)黑色96孔板的待測細(xì)胞，并做好標(biāo)記：包括背景空對(duì)照孔，標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)照孔，以及待測樣品孔 
• 分別加入50微升裂解液（Reagent A）、稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E ）和待測樣品
• 分別加入50微升反應(yīng)工作液 
• 室溫下（25℃），置于平式搖蕩儀孵育2分鐘，速度為50 RPM，避免光照
• 即刻放進(jìn)冷光儀檢測：1秒延時(shí)，1秒檢測
• 獲得相對(duì)發(fā)光單位（Relative Light Unit；RLU）：標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)照孔或待測樣品孔R(shí)LU－背景空對(duì)照孔R(shí)LU
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為相對(duì)發(fā)光單位（RLU）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)ATP濃度（摩爾/升）
• 計(jì)算樣品ATP濃度：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測算

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為50次操作
• 本產(chǎn)品檢測敏感度達(dá)10^-12摩爾/升
• 所有操作均須無菌狀態(tài)下進(jìn)行
• 操作時(shí)，須戴手套
• 建議每個(gè)樣品安排3個(gè)孔，即重復(fù)3次，計(jì)算時(shí)取其平均值
• 強(qiáng)化液（Reagent B）為固體狀，移取方法為：使用1毫升槍頭，將尖端部分剪去；或使用0.5毫升PCR管的蓋子內(nèi)圈盛滿；或秤重0.1克
• 反應(yīng)液（Reagent D）具有光高度敏感性，因此整個(gè)操作須避光進(jìn)行，避免反復(fù)凍融
• 由于ATP無處不在，且熱穩(wěn)定性。建議使用的槍頭、用具須嚴(yán)格無菌，避免重復(fù)使用；操作時(shí)避免污染試劑溶液，不得用手觸摸試劑容器的內(nèi)蓋
• 如果用戶沒有冷光儀，可以使用閃爍探測器（scitillation counter 或β計(jì)數(shù)器）替代，但敏感性較低
• 如果樣品ATP濃度較低，可以整合檢測至10秒
• 如果是注射式冷光儀，建議測試前后使用無離子水沖洗冷光儀注射（injector）管道
• 本公司提供系列ATP檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

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