線蟲甲磺酸乙脂誘導突變試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

線蟲甲磺酸乙脂誘導突變試劑是一種旨在使用烷化劑甲磺酸乙酯誘導線蟲蟲卵發生變異而產生顯性（功能獲得）或隱性（功能缺失）突變株線蟲的權威而經典的技術方法。該技術由科學家長期精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種線蟲，尤其是秀麗隱桿線蟲的誘導突變。可應用于后續表型（功能和行為）和基因型分析，以及分子克隆等。產品嚴格無菌，即到即用，性能穩定，突變頻率高。

技術背景

線蟲（nematode；roundworm）是發育生物學、神經學、細胞生物學研究中的模式生物，其中秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans；C. elegans）是最常見的實驗工具。其獨立生存、非寄生性、體小（1毫米）、易操作和觀察、解剖結構清晰、基因組序列明確（19000多堿基）、產卵量高（300至350）、細胞個數確定（959個）、生活史短（3天）、平均壽命短（2至3周）等特點成為生物學研究的優勢。秀麗隱桿線蟲由5對常染色體和1對性染色體組成，分成雌雄同體（hermaphrodite）和雄性兩種。遺傳篩選通過誘導突變研究產卵系統、肌肉、性別決定、DAUER幼蟲形成、行為變化、性腺形成等發育、生理和行為學的問題。甲磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate，EMS）是一種化學誘變致畸的烷化劑（alkylating agent），誘導基因組DNA序列的G/C為A/T轉換突變（transition mutation）和小片段缺失，產生10至20個基因異常，進行F1（顯性突變）或F2（隱性突變）篩選，從而分析發育、生理或行為特異性的突變線蟲。

產品內容

清理液（Reagent A）      550毫升

處理液（Reagent B）     20毫升

誘變液（Reagent C）    200微升

產品說明書           1份

保存方式

保存在4℃冰箱里；試劑具有毒性，注意操作安全；有效保證6月

用戶自備

6cm細菌培養皿：用于線蟲培養

2.2毫升離心管：用于工作液配制的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管：用于廢棄液體處理的容器

2毫升塑料吸管：用于樣品操作

臺式離心機：用于樣品操作

 1摩爾硫代硫酸鈉（12043）：用于EMS解毒

實驗步驟

一、（選擇步驟）樣品準備

• 準備1個生長在6厘米直徑的瓊脂平板上的成年線蟲
• 加入2毫升清理液（Reagent A）到每個平板上
• 使用2毫升塑料吸管沖洗線蟲，轉移到15毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為1500g
• 小心抽去上清液
• 加入2毫升處理液（Reagent B）
• 上下傾倒，混勻線蟲顆粒群
• 室溫下孵育4分鐘——此為線蟲蟲卵
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為1500g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升清理液（Reagent A）
• 上下傾倒，混勻線蟲蟲卵顆粒群
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為1500g
• 小心抽去上清液
• 重復實驗步驟11至14四次
• 加入5毫升清理液（Reagent A）
• 分別移取250微升鋪展到5個新的含有細菌E.coli OP50的瓊脂平板上
• 在20℃溫度下，孵育52小時
• 直至線蟲處于早期L4幼蟲階段——在陰門部（VULVA）可見白色新月區（CRESCENT），且喂養良好

二、誘導突變

實驗開始前，移取2毫升清理液（Reagent A）到2.2毫升離心管，加入20微升誘變液（Reagent C），混勻，標記為誘變工作液。然后進行下列操作。

• 分別加入2毫升清理液（Reagent A）到每個平板上
• 使用2毫升塑料吸管沖洗線蟲，合并轉移到15毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為1500g
• 小心抽去上清液
• 加入2毫升清理液（Reagent A）
• 上下傾倒，混勻線蟲顆粒群
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為1500g
• 小心抽去上清液
• 加入2毫升上述配置的誘變工作液，混勻
• 在20℃溫度下，平放在平式搖蕩儀上，孵育4小時，速度為50RPM
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為1500g
• 小心抽去上清液（注意：集中在50毫升錐形離心管，最后使用硫代硫酸鈉解毒處理）
• 加入5毫升清理液（Reagent A），混勻
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為1500g
• 小心抽去上清液（注意：集中在50毫升錐形離心管，最后使用硫代硫酸鈉解毒處理）
• 重復實驗步驟13至15二次
• 加入500微升清理液（Reagent A）
• 使用2毫升塑料吸管輕輕抽吸混勻
• 分別移取250微升鋪展到2個新的含有細菌的瓊脂平板上
• 在20℃溫度下靜置20分鐘，或直至平板上液體全部被瓊脂吸收為止
• 挑選處于晚期L4幼蟲階段線蟲——在陰門部（VULVA）可見點狀新月區（DOT CRESCENT）到新的平板上——此為P0線蟲

三、F1和F2突變體篩選

• 在20℃溫度下孵育24小時，獲得P0早期成年線蟲
• 挑選3個P0早期成年線蟲到新的瓊脂平板上
• 進入第一代產卵，獲得35個F1蟲卵
• 在20℃溫度下孵育24小時——此為F1/L1幼蟲
• （選擇步驟）放進-70℃冰箱里凍存F1突變體線蟲株（庫）——建議使用線蟲凍存試劑盒（60060）
• （選擇步驟）或進行后續F1顯性突變表型或基因型分析
• 挑選3個處于F1/L1幼蟲階段的線蟲到新的瓊脂平板上
• 在20℃溫度下孵育5天——此為F2幼蟲
• （選擇步驟）放進-70℃冰箱里凍存F2突變體線蟲株（庫）——建議使用線蟲凍存試劑盒（60060）
• （選擇步驟）或進行后續F2隱性突變表型或基因型分析

注意事項

• 本產品為10次操作
• 本產品適合于Pristionchus pacificus（美國蛔蟲）和Caenorhabditis briggsae等
• 操作時，須戴手套
• 甲磺酸乙酯（EMS）是有毒致畸劑，因此所有接觸過的器皿和用品都要使用1摩爾硫代硫酸鈉（Sodium Thiosulfate；Na₂S₂O₃）沖洗或中和。廢棄溶液里須加入終濃度為1.0摩爾硫代硫酸鈉，在室溫下孵育至少10分鐘，然后廢棄處理掉；并注意操作安全
• 誘變工作液不宜保存 
• 線蟲繁殖培養基建議使用線蟲繁殖培養試劑盒-60058
• 如果需要進行大規模的突變篩選，建議準備數百至上千個培養皿
• 如果暫時延緩線蟲生長，可以將線蟲放進15℃恒溫培養箱里
• 本產品提供系列線蟲誘導突變分析試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定無病毒和支原體污染
• 本產品經鑒定突變頻率高

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