EB病毒DNA純化試劑盒產品說明書

主要用途

 EB病毒DNA純化試劑是一種旨在從感染病人的組織細胞或體液中，提取病毒DNA的權威而經典的技術方法。該技術經過精心改良、成功實驗證明的。其適用于人體培養細胞、組織、血液、體液等樣品。應用于后續核酸擴增、測序等分析。產品即到即用，性能穩定，操作方便，去蛋白程度和DNA分離產量高。

 

技術背景

 

愛潑斯坦巴爾病毒（Epstein-Barr virus；EBV），又稱為人類皰疹病毒4（human herpesvirus 4），是Anthony Epstein和Yvonne Barr于1964年首次成功地將丹尼斯伯基特（Danis Burkitt）發現的非洲兒童淋巴瘤細胞通過體外懸浮培養而建株，并在建株細胞涂片中用電鏡觀察到皰疹病毒顆粒而命名的。形態與其他皰疹病毒相似，圓形、直徑180nm，172kb，基本結構含核樣物、衣殼和囊膜三部分，為皰疹病毒科（herpesviridae）嗜淋巴細胞病毒屬（lymphocryptovirus）的成員。EB病毒是人類最常見的病毒之一，長期潛伏在淋巴細胞內和骨髓里，95％的人會通過唾液感染而無癥狀，但易導致傳染性單核細胞增多癥（infectious mononecleosis），移植后淋巴細胞增殖癥（post-transplantation lymphoproliferative disease；PTLD），以及伯基特淋巴瘤、鼻咽癌等腫瘤。病毒感染宿主細胞后，細胞核內常常存在一些非整合的線形或環狀雙鏈DNA分子，或游離于細胞核外，存在于細胞上清液中，尤其在病人血液中。采用改良的赫特技術分離出EB病毒DNA。

 

產品內容

 

清理液（Reagent A）      60毫升

酶解液（Reagent B）  1毫升

鹽析液（Reagent C）  2毫升

抗干擾液（Reagent D）     200微升

萃取液（Reagent E）      10毫升

濃縮液（Reagent F）  2毫升

沉淀液（Reagent G） 20毫升

凈化液（Reagent H） 20毫升

溶解液（Reagent I）  1毫升

產品說明書     1份

 

保存方式

 

保存酶解液（Reagent B）、抗干擾液（Reagent D）和萃取液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

 

 

 

用戶自備

 

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細胞脫離

完全細胞培養基（12052）：用于中和胰蛋白酶脫離

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺式離心機：用于沉淀

恒溫水槽：用于樣品孵育反應

渦旋震蕩儀：用于混勻樣品反應物

 

實驗步驟

 

• 血液樣品

 

• 準備好不含抗凝劑的儲存管 
• 抽取1毫升血液，置于儲存管里
• 室溫下，靜置30分鐘，直至血液凝結
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血清成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• （選擇步驟）暫時中止，放進－70℃冰箱里保存
• 移取400微升血清到1.5毫升離心管
• 加入50微升酶解液（Reagent B），輕輕混勻
• 放進58℃恒溫水槽孵育2小時
• 加入100微升鹽析液（Reagent C）
• 放進4℃冰箱里孵育2小時或過夜
• 放進4℃微型臺式離心機離心30分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出450微升上清液到新的1.5毫升離心管
• 加入10微升抗干擾液（Reagent D）
• 放進37℃恒溫水槽孵育20分鐘
• 加入450微升萃取液（Reagent E）
• 渦旋震蕩儀上強烈震蕩30秒
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管，留下25微升相位交界面的溶液
• 加入100微升濃縮液（Reagent F）
• 加入1毫升沉淀液（Reagent G）
• 渦旋震蕩儀上強烈震蕩30秒
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升凈化液（Reagent H）
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干
• 加入25微升溶解液（Reagent I）

 

• 細胞培養液或組織洗脫液或其它體液樣品

 

• 移取1毫升細胞培養液、組織洗脫液或其它體液到1.5毫升離心管
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層液體到新的1.5毫升離心管
• （選擇步驟）暫時中止，放進－70℃冰箱里保存
• 移取400微升培養液、洗脫液或其它體液到1.5毫升離心管
• 加入50微升酶解液（Reagent B），輕輕混勻
• 放進58℃恒溫水槽孵育2小時
• 加入100微升鹽析液（Reagent C）
• 放進4℃冰箱里孵育2小時或過夜
• 放進4℃微型臺式離心機離心30分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出450微升上清液到新的1.5毫升離心管
• 加入10微升抗干擾液（Reagent D）
• 放進37℃恒溫水槽孵育20分鐘
• 加入450微升萃取液（Reagent E）
• 渦旋震蕩儀上強烈震蕩30秒
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管，留下25微升相位交界面的溶液
• 加入100微升濃縮液（Reagent F）
• 加入1毫升沉淀液（Reagent G）
• 渦旋震蕩儀上強烈震蕩30秒
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升凈化液（Reagent H）
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干
• 加入25微升溶解液（Reagent I）

 

• 細胞樣品

 

• 準備1個6孔細胞培養板的細胞
• 抽掉6孔細胞培養板里的1孔培養液
• 輕輕沿壁加入2毫升清理液（Reagent A），清洗生長的細胞表面
• 小心抽掉清理液
• 加入500微升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養平面
• 放進37℃培養箱孵育1分種
• 手擊振動培養瓶，使細胞脫落
• 加入1毫升用戶自備的完全細胞培養液
• 移入1.5毫升離心管
• 放進微型臺式離心機離心15秒，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入400微升清理液（Reagent A），混勻
• 加入50微升酶解液（Reagent B），輕輕混勻
• 放進58℃恒溫水槽孵育2小時
• 加入100微升鹽析液（Reagent C）
• 放進4℃冰箱里孵育2小時或過夜
• 放進4℃微型臺式離心機離心30分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出450微升上清液到新的1.5毫升離心管
• 加入10微升抗干擾液（Reagent D）
• 放進37℃恒溫水槽孵育20分鐘
• 加入450微升萃取液（Reagent E）
• 渦旋震蕩儀上強烈震蕩30秒
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管，留下25微升相位交界面的溶液
• 加入100微升濃縮液（Reagent F）
• 加入1毫升沉淀液（Reagent G）
• 渦旋震蕩儀上強烈震蕩30秒
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升凈化液（Reagent H）
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干
• 加入25微升溶解液（Reagent I）

 

四、 組織樣品

 

• 準備好100毫克的組織
• 移入一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
• 移入1.5毫升離心管
• 加入400微升清理液（Reagent A），混勻
• 加入50微升酶解液（Reagent B），輕輕混勻
• 放進58℃恒溫水槽孵育2小時
• 加入100微升鹽析液（Reagent C）
• 放進4℃冰箱里孵育2小時或過夜
• 放進4℃微型臺式離心機離心30分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出450微升上清液到新的1.5毫升離心管
• 加入10微升抗干擾液（Reagent D）
• 放進37℃恒溫水槽孵育20分鐘
• 加入450微升萃取液（Reagent E）
• 渦旋震蕩儀上強烈震蕩30秒
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管，留下25微升相位交界面的溶液
• 加入100微升濃縮液（Reagent F）
• 加入1毫升沉淀液（Reagent G）
• 渦旋震蕩儀上強烈震蕩30秒
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升凈化液（Reagent H）
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干
• 加入25微升溶解液（Reagent I）

 

注意事項

 

• 本產品為20次操作
• 操作時須戴手套
• 整個操作須嚴格注意生物安全
• 酶解液（Reagent B），使用前，須溫育至試劑溶解即可
• 本公司提供系列DNA萃取試劑產品

 

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定去蛋白程度和分離產量高

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