乙肝病毒DNA純化試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

乙肝病毒DNA純化試劑是一種旨在從感染病人的組織細(xì)胞或體液中，提取病毒DNA的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心改良、成功實驗證明的。其適用于人體培養(yǎng)細(xì)胞、組織、體液等樣品。應(yīng)用于后續(xù)核酸擴增、測序等分析。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作方便，去蛋白程度和DNA分離產(chǎn)量高。

 

技術(shù)背景

 

乙肝病毒（Hepatitis B virus；HBV）是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae）。基因組長約3.2kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。HBV侵入人體后，與肝細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，脫去外膜（envelope），穿入肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，然后脫去衣殼（capsid），部分雙鏈環(huán)狀HBVDNA進入肝細(xì)胞核內(nèi)。病毒感染宿主細(xì)胞后細(xì)胞核內(nèi)常常存在一些非整合的線形或環(huán)狀雙鏈DNA分子，或游離于細(xì)胞核外，存在于細(xì)胞上清液中，尤其在病人血液中。采用改良的赫特技術(shù)分離出乙肝病毒DNA。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）      60毫升

酶解液（Reagent B）  1毫升

鹽析液（Reagent C）  2毫升

抗干擾液（Reagent D）     200微升

萃取液（Reagent E）      10毫升

濃縮液（Reagent F）  2毫升

沉淀液（Reagent G） 20毫升

凈化液（Reagent H） 20毫升

溶解液（Reagent I）  1毫升

產(chǎn)品說明書     1份

 

保存方式

 

保存酶解液（Reagent B）、抗干擾液（Reagent D）和萃取液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

 

用戶自備

 

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細(xì)胞脫離

完全細(xì)胞培養(yǎng)基（12052）：用于中和胰蛋白酶脫離

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺式離心機：用于沉淀

恒溫水槽：用于樣品孵育反應(yīng)

渦旋震蕩儀：用于混勻樣品反應(yīng)物

 

實驗步驟

 

• 血液樣品

 

• 準(zhǔn)備好不含抗凝劑的儲存管 
• 抽取1毫升血液，置于儲存管里
• 室溫下，靜置30分鐘，直至血液凝結(jié)
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血清成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• （選擇步驟）暫時中止，放進－70℃冰箱里保存
• 移取400微升血清到1.5毫升離心管
• 加入50微升酶解液（Reagent B），輕輕混勻
• 放進58℃恒溫水槽孵育2小時
• 加入100微升鹽析液（Reagent C）
• 放進4℃冰箱里孵育2小時或過夜
• 放進4℃微型臺式離心機離心30分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出450微升上清液到新的1.5毫升離心管
• 加入10微升抗干擾液（Reagent D）
• 放進37℃恒溫水槽孵育20分鐘
• 加入450微升萃取液（Reagent E）
• 渦旋震蕩儀上強烈震蕩30秒
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管，留下25微升相位交界面的溶液
• 加入100微升濃縮液（Reagent F）
• 加入1毫升沉淀液（Reagent G）
• 渦旋震蕩儀上強烈震蕩30秒
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升凈化液（Reagent H）
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干
• 加入25微升溶解液（Reagent I）

 

• 細(xì)胞培養(yǎng)液或組織洗脫液樣品

 

• 移取1毫升細(xì)胞培養(yǎng)液、組織洗脫液或其它體液到1.5毫升離心管
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層液體到新的1.5毫升離心管
• （選擇步驟）暫時中止，放進－70℃冰箱里保存
• 移取400微升培養(yǎng)液、洗脫液或其它體液到1.5毫升離心管
• 加入50微升酶解液（Reagent B），輕輕混勻
• 放進58℃恒溫水槽孵育2小時
• 加入100微升鹽析液（Reagent C）
• 放進4℃冰箱里孵育2小時或過夜
• 放進4℃微型臺式離心機離心30分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出450微升上清液到新的1.5毫升離心管
• 加入10微升抗干擾液（Reagent D）
• 放進37℃恒溫水槽孵育20分鐘
• 加入450微升萃取液（Reagent E）
• 渦旋震蕩儀上強烈震蕩30秒
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管，留下25微升相位交界面的溶液
• 加入100微升濃縮液（Reagent F）
• 加入1毫升沉淀液（Reagent G）
• 渦旋震蕩儀上強烈震蕩30秒
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升凈化液（Reagent H）
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干
• 加入25微升溶解液（Reagent I）

 

• 細(xì)胞樣品

 

• 準(zhǔn)備1個6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞
• 抽掉6孔細(xì)胞培養(yǎng)板里的1孔培養(yǎng)液
• 輕輕沿壁加入2毫升清理液（Reagent A），清洗生長的細(xì)胞表面
• 小心抽掉清理液
• 加入500微升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養(yǎng)平面
• 放進37℃培養(yǎng)箱孵育1分種
• 手擊振動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
• 加入1毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入1.5毫升離心管
• 放進微型臺式離心機離心15秒，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入400微升清理液（Reagent A），混勻
• 加入50微升酶解液（Reagent B），輕輕混勻
• 放進58℃恒溫水槽孵育2小時
• 加入100微升鹽析液（Reagent C）
• 放進4℃冰箱里孵育2小時或過夜
• 放進4℃微型臺式離心機離心30分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出450微升上清液到新的1.5毫升離心管
• 加入10微升抗干擾液（Reagent D）
• 放進37℃恒溫水槽孵育20分鐘
• 加入450微升萃取液（Reagent E）
• 渦旋震蕩儀上強烈震蕩30秒
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管，留下25微升相位交界面的溶液
• 加入100微升濃縮液（Reagent F）
• 加入1毫升沉淀液（Reagent G）
• 渦旋震蕩儀上強烈震蕩30秒
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升凈化液（Reagent H）
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干
• 加入25微升溶解液（Reagent I）

 

四、 組織樣品

 

• 準(zhǔn)備好100毫克的組織
• 移入一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
• 移入1.5毫升離心管
• 加入400微升清理液（Reagent A），混勻
• 加入50微升酶解液（Reagent B），輕輕混勻
• 放進58℃恒溫水槽孵育2小時
• 加入100微升鹽析液（Reagent C）
• 放進4℃冰箱里孵育2小時或過夜
• 放進4℃微型臺式離心機離心30分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出450微升上清液到新的1.5毫升離心管
• 加入10微升抗干擾液（Reagent D）
• 放進37℃恒溫水槽孵育20分鐘
• 加入450微升萃取液（Reagent E）
• 渦旋震蕩儀上強烈震蕩30秒
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管，留下25微升相位交界面的溶液
• 加入100微升濃縮液（Reagent F）
• 加入1毫升沉淀液（Reagent G）
• 渦旋震蕩儀上強烈震蕩30秒
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升凈化液（Reagent H）
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干
• 加入25微升溶解液（Reagent I）

 

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時須戴手套
• 整個操作須嚴(yán)格注意生物安全
• 酶解液（Reagent B），使用前，須溫育至試劑溶解即可
• 通常血清中自然乙肝病毒DNA的南方雜交（southern blot）圖像（見下圖）顯示三條帶：4.0kb松弛型環(huán)狀雙鏈DNA、3.2kb線性雙鏈DNA和介于上述之間的彌散的松弛型環(huán)狀部分雙鏈DNA。而體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染的乙肝病毒DNA的帶型取決于感染的時間、感染的病毒量（病毒復(fù)數(shù)）以及DNA純度。

 

• 本公司提供系列DNA萃取試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定去蛋白程度和分離產(chǎn)量高

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