血液凝血酶/活化因子II（THROMBIN/FACTOR IIa）活性熒光定量檢測

試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

血液凝血酶/活化因子II（THROMBIN/FACTOR IIa）活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過多肽化合物底物H-D-Phe-Pip-Arg-AMC受到凝血酶的水解，釋放出熒光產物氨甲基香豆素，產生熒光峰值的變化，即采用熒光法來測定血液樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種血漿樣品（動物、人體等）凝血酶的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

 

技術背景

 

凝血酶（THROMBIN；EC3.4.21.5），又稱為活化因子II（Activated Factor II；Factor IIa），屬于絲氨酸蛋白酶，存在于血液循環中的凝血蛋白。其原酶分子量是72kd，由活化因子X（Activated Factor X；Factor Xa）所切離產生的活化凝血酶分子量是36kd。其功能在于將血漿中可溶性纖維蛋白原（fibrinogen）轉化為不溶性纖維蛋白凝塊（fibrin clot），活化因子XI、V、VIII，XIII等，以及促進血小板聚集等凝血機制方面發揮重要作用。凝血酶影響一系列正常和病理反應，包括炎癥、組織修復、胚胎形成、血管形成、腫瘤浸潤等。凝血酶基因突變將導致血栓形成（thrombosis）。凝血酶的目標蛋白切離部位為Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser。凝血酶的抑制劑是苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride；PMSF）。基于人工合成的多肽化合物底物H-D-Phe-Pip- Arg-7-amido-4-methylcoumarin（HD-苯丙氨酰- pipecolyl-精氨酰氨甲基香豆素）受到凝血酶的水解，釋放出熒光7-氨基-4-甲基香豆素（7-amido-4-methylcoumarin；AMC；激發波長360nm；散發波長460nm），來定量測定凝血酶的活性。其反應系統為：

 

Thrombin

H-D-Phe-Pip- Arg-AMC    →  H-D-Phe-Pip- Arg-OH  +   AMC

                                

 

產品內容

 

緩沖液（Reagent A）   2毫升

底物液（Reagent B）   500微升

標準液（Reagent C）  50微升

產品說明書   1份

 

保存方式

 

保存在-20℃冰箱里；底物液（Reagent B）和標準液（Reagent C）避免光照和反復凍融；有效保證6月

 

 

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺式離心機：用于樣品操作

培養箱：用于反應物孵育

黑色96孔板或100微升1厘米光徑比色皿：用于樣品熒光測定的容器

熒光酶標儀或熒光分光光度儀：用于樣品熒光分析

 

實驗步驟

  

• 樣品制備

 

• 準備好肝素或ACD抗凝管（注意：避免使用EDTA抗凝管）
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻置于冰槽里備用或放進－70℃冰箱里保存

 

• 測定準備

 

• 準備好待測樣品，置于冰槽里
• 設定好熒光分光光度儀（溫度為37℃）：激發波長360nm，散發波長460nm，并置零 
• 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 分別加入25微升緩沖液（Reagent A）到2至5號管
• 移取50微升標準液（Reagent C）到1號管，混勻
• 小心移取25微升1號管稀釋的標準液（Reagent C）到2號管，混勻
• 小心移取25微升2號管稀釋的標準液（Reagent C）到3號管，混勻
• 小心移取25微升3號管稀釋的標準液（Reagent C）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

 

管號	緩沖液（Reagent A）	標準液（Reagent C）	標準AMC濃度
1		50微升	5微摩爾/升
2	25微升	25微升1號管	2.5微摩爾/升
3	25微升	25微升2號管	1.25微摩爾/升
4	25微升	25微升3號管	0.625微摩爾/升
5	50微升	0	0

 

• 標準曲線測定

 

• 移取70微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入20微升底物液（Reagent B）
• 加入10微升上述配制的標準液
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 即刻放進熒光分光光度儀檢測：獲得相對熒光讀數（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 重復實驗步驟1至6四次
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為相對熒光單位（RFU）；橫座標（X軸）為標準AMC濃度（微摩爾/升）

 

• 樣品測定

 

• 移取70微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入20微升底物液（Reagent B）
• 加入10微升待測樣品（50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 即刻放進熒光分光光度儀檢測：獲得樣品相對熒光讀數（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 根據標準曲線獲得樣品對應AMC濃度（微摩爾/升）

 

• 計算樣品實際活性

 

[根據標準曲線獲得樣品對應AMC濃度（微摩爾/升）X樣品稀釋倍數]÷ 60（分鐘）＝納摩爾/毫升•分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝納摩爾/毫克•分鐘

 

• 熒光酶標儀測定

 

• 在黑色96孔板上做好相應標記：標準樣品和待測樣品
• 分別移取70微升緩沖液（Reagent A）到相應孔里
• 分別加入20微升底物液（Reagent B）
• 分別加入10微升上述配制的標準液或待測樣品（50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動黑色96孔板
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 即刻放進熒光酶標儀檢測：獲得相對熒光讀數
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為相對熒光單位；橫座標（X軸）為標準AMC濃度（微摩爾/升）
• 根據標準曲線獲得樣品對應AMC濃度（微摩爾/升）
• 樣品實際活性計算：

 

根據標準曲線獲得樣品對應AMC濃度（微摩爾/升）X樣品稀釋倍數]÷ 60（分鐘）＝納摩爾/毫升•分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝納摩爾/毫克•分鐘

 

注意事項

 

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，標準曲線測定只需1次
• 樣品須澄清，且避免反復凍融
• 測定值由低到高變化；測定可持續60分鐘
• 熒光測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測定60分鐘讀數高于0分鐘讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 可以使用凝血酶抑制劑，N-α-NAPAP，作為抑制劑對照或陰性對照
• 凝血酶/活化因子II單位活性定義為：在37℃，pH 7..5條件下，每分鐘內能夠切離1微摩爾多肽化合物底物H-D-Phe-Pip- Arg-AMC所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列凝血因子檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感

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