細胞樣品組織因子（TISSUE FACTOR）活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

組織樣品組織因子（TISSUE FACTOR）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過凝血酶原復合物，在鈣離子的參與下，與組織因子結合，其中的因子X被激活，進而使用人工合成的多肽化合物底物Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA發生水解，釋放黃色對硝基苯胺，產生吸光峰值的變化，即采用比色法來測定細胞裂解萃取樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體等）組織因子的活性檢測，以及抑制劑和激活劑篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

 

技術背景

 

組織因子（TISSUE FACTOR；TF），又稱為血小板組織因子（platelet tissue factor）、因子III（Factor III）、凝血酶原激酶（thrombokinase）和CD42等，是一種跨膜載脂蛋白（apoprotein），分子量46Kd，細胞表面單鏈糖蛋白，存在于腦、肺、血管、胎盤、腫瘤組織、單核細胞、成纖維細胞，以及腦脊液、尿液和羊水中。其功能在于啟動外源性組織因子依賴性凝血通路（extrinsic pathway），在鈣離子的存在下，作為絲氨酸蛋白酶的輔因子，通過與因子VII等量（stoichiometric）結合，形成復合物，自動切離（autocleaving）并變構（allosteric）激活因子VII，增強其酰胺水解（amidolytic）活性，從而切離下游因子X和IX，導致凝血酶（thrombin）產生，激活正常凝血機制。組織因子受到革蘭氏陰性細菌膿毒癥（sepsis）、急性冠狀動脈綜合征（coronary syndrome）、彌散性血管內凝血（disseminated intravascular coagulation；DIC）等誘導而高度表達。其表達異常，與腎病、神經系統疾病、炎癥、癌癥、敗血癥、器官移植等有關。基于凝血酶原復合物（prothrombin comlex；含有因子II、VII、IX、X等），在鈣離子的參與下，與組織因子結合，其中的因子X被激活，進而使用人工合成的多肽化合物底物Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA（苯甲酰異亮氨酰谷氨酰甘氨酰精氨酰對硝基苯胺）發生水解，釋放有色對硝基苯胺，在分光光度儀（405nm波長）下，測定吸光峰值的變化，來定量測定組織因子的活性。其反應系統為：

Ca⁺⁺

Tissue Factor  +  Factor VII（prothrombin comlex）   →  TF/FVII complex

 

Factor VII    →   Factor VIIa

 

Factor VIIa

Factor X    →   Factor Xa

 

Factor Xa

Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA       →      Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-OH  +   pNA

                                      （黃色）

 

產品內容

 

清理液（Reagent A） 120毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

緩沖液（Reagent C）   2毫升

反應液（Reagent D） 400微升

終止液（Reagent E）   1毫升

陰性液（Reagent F）     1毫升

底物液（Reagent G）     1毫升

穩定液（Reagent H）     1毫升

產品說明書      1份

 

保存方式

 

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；反應液（Reagent D）和底物液（Reagent G）避免光照和反復凍融；有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品制備和儲存的容器

細胞刮脫棒：用于脫離細胞

微型臺式離心機：用于樣品操作

培養箱：用于反應物孵育

96孔板或100微升1厘米光徑比色皿：用于樣品比色測定的容器

酶標儀或分光光度儀：用于樣品比色分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑置入冰槽里融化，避免光照。然后進行下列操作。

 

• 樣品制備

 

• 準備好25cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

 

• 測定準備

 

• 準備好上述制備的待測樣品
• 設定好分光光度儀或酶標儀（溫度為37℃）：波長405nm，并置零
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

• 活性測定

 

• 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取60微升緩沖液（Reagent C）到相應孔里
• 分別加入20微升陰性液（Reagent F）或上述制備的待測樣品（50微克蛋白）到相應孔里（注意：樣品須清澈）
• 分別加入20微升反應液（Reagent D）
• 輕輕搖動96孔板（注意：避免氣泡）
• 在37℃溫度下孵育10分鐘
• 分別加入50微升終止液（Reagent E），混勻
• 分別加入50微升底物液（Reagent G），混勻
• 在37℃溫度下孵育30分鐘（注意：可見反應孔里呈現肉眼可見的黃色）
• 分別加入50微升穩定液（Reagent H）
• 即刻放進酶標儀檢測或轉移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測
• 活性計算：

 

• 酶標儀檢測

 

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.02（樣品容量；毫升）X 8.8（毫摩爾吸光系數）X 10（反應時間；分鐘）X 0.6（光徑距離；厘米）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾對硝基苯酚/分鐘

 

• 比色皿檢測

 

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.10（體系容量；毫升）]÷[0.02（樣品容量；毫升）X 8.8（毫摩爾吸光系數）X 10（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾對硝基苯酚/分鐘

 

注意事項

 

• 本產品為20次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，且避免反復凍融
• 測定值由低到高變化；測定可持續30分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測定30分鐘讀數高于0分鐘讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/20微升；如果樣本酶活性過低，則可以延長反應孵育時間；其次增加樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 組織因子單位活性定義為：在37℃，pH 7.8條件下，每分鐘內能夠釋放1微摩爾對硝基苯酚所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列凝血因子檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感

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