植物β-淀粉酶（β-AMYLASE）活性PNPG5酶偶聯比色法定量檢測試劑盒

產品說明書（中文版）

主要用途

植物β-淀粉酶（β-AMYLASE）活性PNPG5酶偶聯比色法定量檢測試劑是一種旨在通過β-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的酶偶聯反應體系中，底物對硝基苯基α-D-麥芽五糖水解產生顯色產物對硝基苯酚，即采用比色法測定其吸收峰值的變化，來測定樣品中β-淀粉酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種新鮮植物組織，包括葉片（leaf）、谷粒（grain）、種子（seed）等裂解萃取液樣品中β-淀粉酶的活性檢測。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，反應優化，檢測敏感。

 

技術背景

 

淀粉酶（AMYLASE）屬于糖苷水解酶類（glycoside hydrolase）。淀粉酶通過水解方式，分解淀粉的α-1,4鏈接，釋放出葡萄糖、麥芽糖（maltose）、麥芽三糖（maltotriose）、糊精（dextrin）等簡單糖分子。淀粉酶分成三類：α-淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶。其中α淀粉酶（EC 3.2.1.1），又稱為α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶（α-1,4-glucan 4-glucanohydrolase）或糖原酶（glycogenase），是鈣離子依賴性鈣金屬蛋白酶（calcium metalloenzyme），分解淀粉為葡萄糖、麥芽糖（maltose）、麥芽三糖（maltotriose）、糊精（dextrin）等，為主要的消化酶，尤其在人體中，例如唾液和胰淀粉酶等。β淀粉酶（EC 3.2.1.2），又稱為α-1,4-葡聚糖麥芽糖水解酶（1,4-α-D-glucan maltohydrolase）或糖基淀粉酶（saccharogen amylase），分解淀粉為葡萄糖等。植物、真菌、細菌等均能產生，而人體組織不含有。γ-淀粉酶（EC 3.2.1.2），又稱為α-1,4-葡聚糖葡萄糖苷酶（Glucan 1,4-α-glucosidase）或溶酶體α-葡萄糖苷酶（lysosomal α-glucosidase），在酸性環境下分解淀粉為葡萄糖。淀粉是一種復雜分子，由多聚糖直鏈淀粉（amylose）和支鏈淀粉（amylopectin）構成。植物和細菌產生大多數淀粉。在淀粉酶的催化作用下，分解產生簡單糖分子，作為能源儲存，植物用于光合作用。植物和細菌性淀粉酶常用于工業，包括烘培食物和乳制品的制造，以及酒精和紙材的生產�；�于底物對硝基苯基α-D-麥芽五糖（p-nitrophenyl-α-D-maltopentaoside；PNPG5），通過β-淀粉酶的水解，釋放出麥芽糖（maltose）和對硝基苯基α-D-麥芽三糖（p-nitrophenyl-α-D-maltotrioside；PNPG3），進而在α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）的催化下，產生葡萄糖（glucose）和顯色產物對硝基苯酚（p-nitrophenol），在分光光度儀（410nm波長）下測定，以定量分析β-淀粉酶的特異活性。其反應方式為：   

β-AMYLASE

PNPG5  +  H2O       →     PNPG3  +   Maltose

 

          α-glucosidase

Maltose   +  PNPG3  →  p-Nitrophenol  +  Glucose

 

產品內容

 

萃取液（Reagent A） 100毫升

緩沖液（Reagent B）  75毫升

底物液（Reagent C）  1.2毫升

終止液（Reagent D）     20毫升

產品說明書      1份

 

保存方式

 

保存緩沖液（Reagent B）和底物液（Reagent C）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent C）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于樣品操作操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

DOUNCE勻漿器：用于勻化組織樣品

尼龍網（nylon mesh）：用于去除殘渣

4℃臺式離心機：用于樣品處理

比色皿：用于比色測定的容器

分光光度儀：用于比色分析

 

實驗步驟

 

一、樣品準備

 

• 準備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并精確秤重以確定500毫克組織重量 
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入5毫升萃取液（Reagent A）
• 渦旋震蕩10秒，充分混勻
• 室溫下孵育60分鐘，期間每隔10分鐘渦旋震蕩10秒
• 準備1個小型漏斗，內襯尼龍絲或150微米的尼龍網（nylon mesh），置于15毫升錐形離心管上
• 將所有組織勻漿物移入到小型漏斗里過濾
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移取無渣液分裝到預冷的1.5毫升離心管
• 移取50微升到新的15毫升錐形離心管
• 加入2.5毫升緩沖液（Reagent B），混勻
• 移取50微升到新的1.5毫升離心管，混勻
• 加入1.25毫升緩沖液（Reagent B），混勻
• 置于冰槽里繼續后續操作（注意：后續操作須在2小時內完成）

 

二、測定準備

 

• 準備好待測樣品，置于冰槽里
• 設定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長為410nm，并置零 
• 將－20℃冰箱里的試劑盒中的底物液（Reagent C）置入冰槽里融化，避免光照
• 緩沖液（Reagent B）室溫下均衡溫度

 

• 背景測定

 

• 移取50微升底物液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入50微升緩沖液（Reagent B）
• 40℃溫度下，孵育10分鐘
• 加入750微升終止液（Reagent D），混勻
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數，此為背景讀數

 

• 樣品測定

 

• 移取50微升底物液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入50微升上述制備的待測樣品
• 40℃溫度下，孵育10分鐘
• 加入750微升終止液（Reagent D），混勻
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數，此為樣品讀數

 

• 計算樣品活性

 

[（樣品讀數－背景讀數）X 0.85（體系容量；毫升）X 1250 （樣品稀釋倍數）]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 17.8（毫摩爾吸光系數）X 10（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷100（樣品重量；毫克/毫升）＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾對硝基苯酚/分鐘

 

注意事項

 

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 底物液（Reagent C）避免反復凍融，注意避光
• 樣品檢測前，須溶解和澄清
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 測定值由低到高變化，表明有酶活性
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度和用量
• β-淀粉酶活性單位濃度定義：在40℃溫度，pH 6.2的情況下，每單位酶在單位時間內（每分鐘）釋放1微摩爾的對硝基苯酚
• 本公司提供系列淀粉酶分析技術產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測準確

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