組織樣品組織型纖維蛋白溶酶原激活劑（tPA）活性熒光定量檢測試劑盒

產品說明書（中文版）

主要用途

組織樣品組織型纖維蛋白溶酶原激活劑（tPA）活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過多肽化合物底物CH3SO2-D-HHT-Gly-Arg-AMC受到組織型纖維蛋白溶酶原激活劑的水解，釋放熒光產物7-氨基-4-甲基香豆素，產生熒光峰值的變化，即采用熒光法來測定組織裂解萃取樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動物、人體等）組織型纖維蛋白溶酶原激活劑（tPA）的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

 

技術背景

 

組織型纖維蛋白溶酶原激活劑（tissue type Plasminogen Activator；tPA或PLAT；EC3.4.21.68），屬于絲氨酸蛋白酶，存在于內皮細胞（endothelial）中。其功能在于使纖維蛋白溶酶原（Plasminogen），即纖維蛋白溶酶（plasmin）的酶原形式（zymogen）轉化為具有活性的纖維蛋白溶酶，水解可溶性纖維蛋白（fibrin），參與血管內血栓溶解通路，以及細胞遷移和組織重塑。在神經系統，組織型纖維蛋白溶酶原激活劑與突觸可塑性（synaptic plasticity）、細胞凋亡等有關。活性過高，則導致纖溶亢進（hyperfibrinolysis），而出血過多，但在腫瘤轉移中起到抑制作用；活性過低，則導致纖溶不足，而血栓形成，或神經退行性變化。一旦異常，將產生肺栓塞、心肌梗塞和中風。臨床上用于治療血栓性中風（embolic or thrombotic stroke）和心肌梗塞。同時高度表達的組織型纖維蛋白溶酶原激活劑時乳腺癌的預后良好的標記。人體血漿中含有纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑I（plasminogen activator inhibitor type 1；PAI-1）和C1抑制劑。基于人工合成的多肽化合物底物CH3SO2-D-HHT-Gly-Arg-AMC（Methylsulfonyl-D-hexahydrotyrosine-glycyl-arginine-7-amino-4-methyl coumarin；甲基磺酰-D-六氫酪氨酸甘氨酰精氨酰氨甲基香豆素）受到組織型纖維蛋白溶酶原激活劑的水解，釋放熒光產物7-氨基-4-甲基香豆素，在熒光分光光度儀（激發波長360nm，散發波長460nm）下，測定熒光峰值的變化，來定量測定組織型纖維蛋白溶酶原激活劑的活性。其反應系統為：

 

tPA

CH3SO2-D-HHT-Gly-Arg-AMC       →      CH3SO2-D-HHT-Gly-Arg -OH  +   AMC

                    

產品內容

 

清理液（Reagent A）  60毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

緩沖液（Reagent C） 2.5毫升

底物液（Reagent D）   250微升

標準液（Reagent E）    50微升

產品說明書      1份

保存方式

 

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；底物液（Reagent D）和標準液（Reagent E）避免光照和反復凍融；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品制備和儲存的容器

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織

微型臺式離心機：用于樣品沉淀

培養箱：用于反應物孵育

黑色96孔板或100微升1厘米光徑比色皿：用于樣品熒光測定的容器

熒光酶標儀或熒光分光光度儀：用于樣品熒光分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的底物液（Reagent D）和標準液（Reagent E）室溫下融化，避免光照。然后進行下列操作。

 

• 樣品制備

 

• 手術取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入置于冰槽里的500微升裂解液（Reagent B） 
• 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 即刻放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管
• 移取10微升樣品和10微升裂解液（Reagent B）作為空白對照進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

 

• 測定準備

 

• 準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取液等），置于冰槽里
• 設定好熒光分光光度儀（溫度為37℃）：激發波長360nm，散發波長460nm
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
• 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 分別加入20微升緩沖液（Reagent C）到1至5號管
• 移取20微升標準液（Reagent E）到1號管，混勻
• 小心移取20微升1號管稀釋的標準液（Reagent E）到2號管，混勻
• 小心移取20微升2號管稀釋的標準液（Reagent E）到3號管，混勻
• 小心移取20微升3號管稀釋的標準液（Reagent E）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

 

管號	緩沖液（Reagent C）	標準液（Reagent E）	測定體系 標準氨甲基香豆素濃度
1	20微升	20微升	10微爾/升
2	20微升	20微升1號管	5微摩爾/升
3	20微升	20微升2號管	2.5微摩爾/升
4	20微升	20微升3號管	1.25微摩爾/升
5	20微升	0	0

 

• 標準曲線測定

 

• 在黑色96孔板上做好相應標記：標準樣品1至5號
• 分別移取80微升緩沖液（Reagent C）到所有孔里
• 分別加入10微升上述配制的標準液（Reagent E）到相應孔里 
• 分別加入10微升底物液（Reagent D）到所有孔里
• 輕輕搖動黑色96孔板（注意：避免氣泡）
• 在37℃溫度下孵育10分鐘 
• 即刻放進熒光分光光度儀檢測：獲得相對熒光讀數（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 重復實驗步驟1至7四次
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為相對熒光單位（RFU）；橫座標（X軸）為標準氨甲基香豆素濃度（微摩爾/升）

 

• 樣品活性測定

 

• 移取85微升緩沖液（Reagent C）到相應孔里
• 加入10微升上述制備的待測樣品（50微克蛋白）到相應孔里（注意：樣品須清澈）
• 加入10微升底物液（Reagent D）
• 輕輕搖動黑色96孔板（注意：避免氣泡）
• 在37℃溫度下孵育10分鐘 
• 即刻放進熒光分光光度儀檢測：獲得樣品相對熒光讀數（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 根據標準曲線獲得樣品對應氨甲基香豆素濃度（微摩爾/升）

 

• 計算樣品實際活性

 

[根據標準曲線獲得樣品對應氨甲基香豆素濃度（微摩爾/升）X 0.1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數]÷ [0.01（樣品容量；毫升）X 10（反應時間；分鐘）＝納摩爾/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝納摩爾/毫克/分鐘

 

注意事項

 

• 本產品為25次操作，包括標準測定
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，標準測定只需1次
• 樣品須澄清，且避免反復凍融
• 測定值由低到高變化
• 孵育反應完成后即刻進行熒光測定
• 如果酶活性過低，可以增加反應時間至30分鐘
• 樣本測定10分鐘讀數高于0分鐘讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/10微升（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 組織型纖維蛋白溶酶原激活劑單位活性定義為：在37℃，pH 8.4條件下，每分鐘內能夠切離1微摩爾三肽化合物底物CH3SO2-D-HHT-Gly-Arg-AMC所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列細胞蛋白酶學檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感

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