組織血紅素氧合酶（HEME OXYGENASE）活性比色法定量檢測試劑盒

產品說明書（中文版）

主要用途

組織血紅素氧合酶（HEME OXYGENASE）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過NADPH生成系統(tǒng)和血紅素氧合酶反應系統(tǒng)中，血紅素被水解為膽綠素后其吸光峰值的變化，即采用比色法來測定樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動物、人體）或純化微粒體樣品血紅素氧合酶的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

 

技術背景

 

血紅素氧合酶（heme oxygenase；HO；EC1.14.99.3）是一種催化血紅素分解代謝的微粒體內限速酶，即通過氧化降解游離血紅素為一氧化碳、自由鐵和膽綠素（biliverdin）或結合血紅素產物膽綠素蛋白（verdoglobin）。血紅素氧合酶存在于體內的所有細胞中，在脾臟中活性最高，旨在處理衰老的紅細胞。血紅素氧合酶有3種同工酶：I型為誘導型，又歸類為熱休克蛋白32K（heat shock protein 32K），受到氧化應激、一氧化氮、缺氧、重金屬、細胞因子等激發(fā)；II型為結構型，維持體內內平衡，在腦組織、睪丸、血管上皮細胞高度表達；III型為結構型，具有氧感受作用，不具有催化活性。其中誘導型血紅素氧合酶（血紅素氧合酶-1；HO-1）是機體最重要的內源性保護物質之一，廣泛參與組織細胞的抗氧化應激損傷，是在細胞受損維持其氧化和抗氧化動態(tài)平衡的關鍵因素，成為炎性反應的調節(jié)靶標。此外，淤青的形成便是血紅素氧合酶的作用，由紅色的血紅素轉變?yōu)榫G色的膽綠素，最后變成黃色的膽紅素（bilirubin）。基于底物血紅素（heme），在NADPH生成系統(tǒng)（NADPH generating system）的存在下，由血紅素氧合酶催化分解作用下，產生一氧化碳、自由鐵和膽綠素（biliverdin），由此出現吸光峰值的變化（464nm和530nm波長），來定量測定血紅素氧合酶的活性。其反應系統(tǒng)為：

glucose-6-phosphate dehydrogenase

D-glucose-6-phosphate   +   NADP⁺   →   NADPH   +   6-Phospho-D-gluconate

 

heme oxygenase

Heme  + 2 NADPH  +  O₂  →  biliverdin  +  Fe²⁺  +  CO  +  2 NADP⁺   +  H₂O

 

產品內容

 

清理液（Reagent A）  60毫升

裂解液（Reagent B）  70毫升

緩沖液（Reagent C）  20毫升

反應液（Reagent D）   1毫升

底物液（Reagent E）     1毫升

陰性液（Reagent F）     1毫升

終止液（Reagent G）    20毫升

產品說明書      1份

 

保存方式

 

保存反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent E）避免光照；終止液（Reagent G）具有腐蝕性，注意安全，有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

2毫升離心管：用于樣品反應的容器

恒溫水槽：用于孵育反應

微型臺式離心機：用于樣品操作

超速離心機：用于樣品操作

渦旋震蕩儀：用于混勻反應

比色皿：用于反應和比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

 

實驗步驟

 

• 樣品準備

 

• 手術取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量（實驗前最好使動物空腹12至24小時） 
• （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入3毫升預冷的裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約40下）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃超速離心機離心30分鐘，速度為9000g
• 移取上清液到2個新的1.5毫升離心管
• 放進4℃超速離心機離心60分鐘，速度為100000g
• 小心抽去上清液
• 分別加入200微升裂解液（Reagent B）
• 合并到1個1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

• 測定準備

 

• 準備好待測樣品（例如組織裂解萃取液或微粒體樣品等），置于冰槽里
• 設定好雙波長分光光度儀（溫度為37℃）：波長分別為464nm和530nm，并置零
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

• 樣品測定

 

• 準備2個2毫升離心管，標記為背景管和樣品管
• 分別移取850微升緩沖液（Reagent C）
• 分別加入50微升反應液（Reagent D）
• 分別加入50微升底物液（Reagent E）
• 加入50微升陰性液（Reagent F）到背景管
• 加入50微升待測樣品（100微克微粒體蛋白或500微克組織裂解萃取液蛋白）到樣品管（注意：樣品須清澈）
• 蓋上蓋子，上下傾倒數次，混勻
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 分別加入1毫升終止液（Reagent G）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g（或10000RPM，例如eppendorf 5415）
• 分別移取1毫升綠色液相液體到比色皿
• 即刻放進分光光度儀檢測
• 記錄實際吸光讀數：吸光讀數464nm—吸光讀數530nm

 

四、計算樣品活性

  

[（樣品讀數－背景讀數）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 40000（微摩爾吸光系數）X 1（反應時間；小時）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝納摩爾膽綠素/小時

 

注意事項

 

• 本產品為20次（比色皿）操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 終止液（Reagent G）具有腐蝕性，注意操作安全
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，至關重要 
• 如果酶活性過低，可以增加反應時間至2小時
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 可以使用血紅素氧合酶誘導劑硫酸銅（EC50=0.24毫摩爾）作為誘導劑對照或陽性對照
• 建議待測樣本為微粒體，其蛋白濃度為100微克/50微升；待測樣本為組織裂解懸液，其總蛋白濃度為250至500微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 血紅素氧合酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.4條件下，每小時內能夠產生1納摩爾膽綠素所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列血紅素氧合酶檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩(wěn)定
• 本產品經鑒定檢測敏感

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