細胞II型L-3羥酰基-CoA 脫氫酶/β淀粉樣蛋白結合乙醇脫氫酶活性

光度法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

細胞II型L-3羥酰基-CoA 脫氫酶/β淀粉樣蛋白結合乙醇脫氫酶（HADHII/ABAD）活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過逆向反應中底物還原的同時，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后峰值的降低，即采用光度法來測定細胞裂解樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解懸液樣品（動物、人體、昆蟲等）II型L-3羥酰基-CoA 脫氫酶/β淀粉樣蛋白結合乙醇脫氫酶的總活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

 

技術背景

 

II型L-3羥酰基輔酶A脫氫酶（L-3-Hydroxyacyl-CoA dehydrogenase；HADHII；EC 1.1.1.35），又稱為β淀粉樣蛋白結合乙醇脫氫酶（amyloid β-peptide binding alcohol dehydrogenase；ABAD）、10型17β-羥基類固醇脫氫酶（17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 10；HSD17B10）、2-甲基-3-羥丁酰基輔酶A脫氫酶（2-methyl-3-hydroxybutyryl CoA dehydrogenase；MHBD）等，是一種主要的線粒體酶，屬于短鏈脫氫酶/還原酶（short chain dehydrogenasereductase；SDR）超家族。HADHII/ABAD可逆性地催化線粒體中脂肪酸β氧化的第三步過程，氧化L-3羥酰基-CoA的羥基基團為酮基基團，同時還原NAD^＋為NADH。HADHII/ABAD催化廣譜的底物氧化活性，包括線性醇類、分枝脂肪酸（4至16碳）、羥酰基輔酶A衍生物、3-羥丁酰輔酶A、氨基酸代謝產物和羥類固醇等。其活性區域含有進化保留的谷氨酸-組氨酸對，具有催化作用機制。其為同源四體蛋白，每個單體為27kd。HADHII/ABAD的基因突變和缺失與阿茲罕默癥和巴金森氏癥相關。基于HADHII/ABAD催化反應的可逆性，3-酮乙酰輔酶A（3-ketoacyl-CoA ）在該酶的作用下，轉化為L-3-羥乙酰基輔酶A （L-3-hydroxyacyl-CoA），同時還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），根據NADH的變化（340nm 波長），來定量分析II型L-3羥酰基-CoA 脫氫酶/β淀粉樣蛋白結合乙醇脫氫酶的總活性。HADHII/ABAD反應系統為：

HADHII/ABAD 

3-ketoacyl-CoA  +  NADH  +  H⁺    →  L-3-hydroxyacyl-CoA  +  NAD⁺

（高吸收峰）                （低吸收峰）

 

產品內容

 

清理液（Reagent A） 120毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

緩沖液（Reagent C）   5毫升

反應液（Reagent D）      500微升

底色液（Reagent E）   500微升

陰性液（Reagent F）   500微升

產品說明書      1份

 

 

保存方式

 

保存裂解液（Reagent B）、緩沖液（Reagent C）、反應液（Reagent D）和底色液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底色液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

比色皿或96孔板：用于光度分析的容器

分光光度儀或酶標儀：用于光度分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

 

• 樣品準備

 

• 準備好25cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

 

• 測定準備

 

• 開啟并設定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長340nm，間隔60秒，讀數6次（共5分鐘），并置零
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底色液（Reagent E）避免光照
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

• 背景對照測定

 

• 移取195微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入25微升反應液（Reagent D）
• 加入25微升底色液（Reagent E）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 加入5微升陰性液（Reagent F）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（0分鐘讀數－5分鐘讀數）

 

• 樣品測定

 

• 移取195微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入25微升反應液（Reagent D）
• 加入25微升底色液（Reagent E）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 加入5微升待測樣品（20微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（0分鐘讀數－5分鐘讀數）

 

五、計算樣品活性

 

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數）X 5（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾NADH/分鐘

 

• 酶標儀測定

 

• 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取195微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 分別加入25微升反應液（Reagent D）
• 分別加入25微升底色液（Reagent E）
• 輕輕搖動96孔板
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入5微升陰性液（Reagent F）或待測樣品（20微克蛋白）到相應孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和5分鐘讀數
• 活性計算：

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數）X 0.6（光徑距離；厘米）X 5（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾NADH/分鐘

 

注意事項

 

• 本產品為20次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 建議使用比色皿測定
• 樣品須澄清，至關重要
• 加樣后3秒內光度測定
• 測定值由高到低變化；測定可持續10分鐘
• 光度測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測定0分鐘讀數高于5分鐘讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為20微克/5微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• II型L-3羥酰基-CoA 脫氫酶/β淀粉樣蛋白結合乙醇脫氫酶單位活性定義為：在25℃，pH 7.0條件下，每分鐘內能夠轉化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列線粒體酶學檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感

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