組織環(huán)氧化酶總活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

組織環(huán)氧化酶（CYCLOOXYGENASE）總活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過底物花生四烯酸在環(huán)氧化酶催化的加氧和過氧化作用產(chǎn)生前列腺素H2的同時，輔助生色底物四甲基對苯二胺鹽酸鹽氧化后峰值的增高，即采用比色法來測定組織裂解萃取樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解萃取懸液樣品（動物、人體、植物、昆蟲等）環(huán)氧化酶的總活性檢測以及抑制劑篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

環(huán)氧化酶（cyclooxygenase；COX；EC1.14.99.1），又稱為前列腺素H合成酶（prostaglandin H synthase；PGHS），是一種具有環(huán)氧化酶和過氧化酶活性的二重功能的酶，其功能在于生成重要的生物調(diào)節(jié)因子（mediator）前列腺素類物質(zhì)（prostanoids），包括前列腺素（prostaglandin；PG）、環(huán)前列腺素（Prostacyclin；PGI2）、血栓素（Thromboxane）等。環(huán)氧化酶有2種同工酶，70KD的環(huán)氧化酶1（COX-1）和72KD的環(huán)氧化酶2（COX-2），其中環(huán)氧化酶1有一種變異體，稱為環(huán)氧化酶3、環(huán)氧化酶1b或環(huán)氧化酶1v（COX-1 variant）。同工酶具有65％的氨基酸序列同源和近似相同的催化部位，但抑制位置不同。環(huán)氧化酶1為結(jié)構(gòu)性（constitutive）酶，存在于大多數(shù)哺乳動物細胞內(nèi)，尤其在腫瘤細胞中高度表達；環(huán)氧化酶2為誘導(dǎo)性（inducible）酶，在正常組織中難以檢測，炎癥后或佛波醇酯（phorbol ester）、脂多糖、細胞因子等誘導(dǎo)激活，尤其在巨噬細胞表達顯著增高。環(huán)氧化酶中的加氧作用催化花生四烯酸（arachidonic acid；AA），一種ω-6多不飽和脂肪酸（ω-6 PUFA），轉(zhuǎn)化為氫過氧化內(nèi)過氧化物前列腺素G2（hydroperoxy endoperoxide prostaglandin G₂；PGG₂）；環(huán)氧化酶中的過氧化作用催化氫過氧化內(nèi)過氧化物前列腺素G2還原為前列腺素醇類物質(zhì)前列腺素H2（prostaglandin H2；PGH2），即前列腺素類物質(zhì)前體。非類固醇類抗炎藥物，例如阿司匹林和異丁苯丙酸（ibuprofen）等是環(huán)氧化酶抑制劑，用于緩解炎癥和疼痛。基于底物花生四烯酸在環(huán)氧化酶催化的加氧作用下，轉(zhuǎn)化成前列腺素G2，同時在還原性輔助生色底物四甲基對苯二胺鹽酸鹽（N,N,N',N'-Tetramethyl- p-phenylenediamine；TMPD）的存在下，環(huán)氧化酶進一步催化其過氧化作用，還原前列腺素G2為前列腺素H2，同時氧化生色底物為藍色產(chǎn)物，通過其吸光峰值的變化（590nm 波長），來定量分析環(huán)氧化酶的總活性。環(huán)氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

 

Cyclooxygenase

arachidonic acid    →   prostaglandin G₂   

                             

peroxidase

prostaglandin G₂  +  2 reduced TMPD   →   prostaglandin H2   +  2 oxidized TMPD

              

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）  60毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

緩沖液（Reagent C）   3毫升

反應(yīng)液（Reagent D）      200微升

底物液A（Reagent E1）   1毫升

底物液B（Reagent E2）        4管

陰性液（Reagent F）   500微升

產(chǎn)品說明書      1份

 

保存方式

 

保存緩沖液（Reagent C）、反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里； 其余的保存在4℃冰箱里，反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；底物液B（Reagent E2）嚴(yán)禁反復(fù)凍融；有效保證2月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

超聲儀：用于組織細胞裂解

勻漿器：用于組織細胞裂解

（微型）臺式離心機：用于樣品制備

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

 

• 樣品準(zhǔn)備

 

• 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個1.5毫升離心管
• 加入預(yù)冷的500微升裂解液（Reagent B）
• 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 在冰槽里，置于200瓦超聲儀下，功率50％，猝擊10秒，間隙10秒冷卻，重復(fù)3次
• （選擇步驟）或即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• （選擇步驟）在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下） 
• 將所有組織裂解液移入到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

• 測定準(zhǔn)備

 

• 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長590nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底物液（Reagent E）避免光照
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
• 實驗開始前，將底物液A（Reagent E1）和1管底物液B（Reagent E2）融化，然后移取250微升底物液A（Reagent E1）到1管底物液B（Reagent E2）里，混勻，標(biāo)記為底物工作液（可以進行5次測定），置于冰槽里備用。然后進行下列操作。

 

• 背景對照測定

 

• 移取140微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入10微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入50微升底物工作液
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在25℃溫度下孵育5分鐘
• 加入50微升陰性液（Reagent F）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

 

• 樣品測定

 

• 移取140微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入10微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入50微升底物工作液
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在25℃溫度下孵育5分鐘
• 加入50微升待測樣品（50微克蛋白）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

 

• 計算樣品活性

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 0.25（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 8.26（毫摩爾吸光系數(shù)）X 5（反應(yīng)時間；分鐘）X 2]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾TMPD/分鐘

 

• 酶標(biāo)儀測定

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品
• 分別移取140微升緩沖液（Reagent C）到所有孔里
• 分別加入10微升反應(yīng)液（Reagent D）到所有孔里
• 分別加入50微升底物工作液到所有孔里
• 輕輕搖動96孔板
• 在25℃溫度下孵育5分鐘
• 分別加入50微升陰性液（Reagent F）或待測樣品（50微克蛋白）到相應(yīng)孔里
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標(biāo)儀檢測，包括0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
• 活性計算

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 8.26（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（光徑距離；厘米）X 5（反應(yīng)時間；分鐘）X 2]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾TMPD/分鐘

 

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 避免使用SDS、Triton 100、Tween 20、Chaps、EGTA、DTT等處理樣本，否則干擾檢測
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 底物工作液現(xiàn)做現(xiàn)配，不宜保存
• 建議使用比色皿測定
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 加樣后3秒內(nèi)比色測定
• 測定值由低到高變化；測定可持續(xù)5分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測定5分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 環(huán)氧化酶單位活性定義為：在25℃，pH 8.0條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾四甲基對苯二胺鹽酸鹽所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列細胞環(huán)氧化酶學(xué)檢測試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

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