線粒體呼吸鏈復合物IV活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

線粒體呼吸鏈復合物IV（細胞色素C－氧化還原酶）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過細胞色素C氧化酶反應系統中還原性細胞色素C氧化后吸光峰值的降低，即采用比色法測定樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種線粒體（動物、人體、酵母等）呼吸鏈復合物IV的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，活體檢測，操作簡捷，性能穩定。

 

技術背景

 

線粒體呼吸鏈復合物IV （Mitochondria Complex IV），又稱為細胞色素C氧化還原酶（cytochrome c oxidoreductase）或細胞色素C氧化酶（Cytochrome c oxidase），存在于真核生物的細胞線粒體上，主要通過氧化磷酸化為細胞提供能量。呼吸鏈復合物IV是由13種不同的亞體構成的復合物，其中含有2個血紅素（heme）基團（a和a3）和2個銅原子，作為輔基（prosthetic groups）。呼吸鏈復合物IV的遺傳變異導致氧化磷酸化類疾病，包括阿茨罕默綜合癥和腫瘤等。基于底物還原型細胞色素C（reduced cytochrome c），受到呼吸鏈復合物IV的催化，轉化為氧化型細胞色素C（oxidized cytochrome c），在分光光度儀下，出現吸光值的變化（550nm 波長），由此定量測定呼吸鏈復合物IV的活性。呼吸鏈復合物IV反應系統為： 

 

Complex IV

4 cytochrome c^2＋  +  8H⁺   +  O₂   →  4 cytochrome c³⁺  +  2H₂O  +  4H⁺

reduced       oxidized

↑Abs 550 nm               ↓Abs 550 nm

 

產品內容

 

緩沖液（Reagent A）  20毫升

反應液（Reagent B）   2毫升

稀釋液（Reagent C）     1毫升

穩定液A（Reagent D1）   1管

穩定液B（Reagent D2） 250微升

產品說明書      1份

 

保存方式

 

緩沖液（Reagent A）和稀釋液（Reagent C）保存在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；反應液（Reagent B）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于反應液配制的容器

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的穩定液B（Reagent D2）置入冰槽里融化，然后移出250微升到穩定液A（Reagent D1）管里，混勻后，標記為穩定工作液，置于冰槽里備用（注意，用完后即刻放回－20℃冰箱里）。然后將－20℃冰箱里的試劑盒中的反應液（Reagent B）置入冰槽里融化；然后移出100微升到新的1.5毫升離心管，加入3微升穩定工作液，輕柔混勻后，室溫下避光靜置15分鐘（可見顏色變化），置于冰槽里，標記為反應工作液（注意：見注意事項6），放在暗室里。然后進行下列操作。

 

• 測讀準備

 

• 準備好含有復合物IV的樣品，置于冰槽里
• 設定好分光光度儀：溫度25℃，波長550nm，間隔10秒，測讀7次（共60秒），并置零或設置0秒和60秒各測讀1次
• 緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

 

• 背景對照測定

 

• 移取800微升緩沖液（Reagent A）到新的1毫升比色皿
• 加入100微升稀釋液（Reagent C）
• 上下傾倒數次，混勻
• 室溫下孵育3分鐘
• 加入100微升含有反應液（Reagent B）和穩定液（Reagent D）的反應工作液
• 上下傾倒數次，混勻
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（0秒讀數－60秒讀數），正常讀數差值為0.001至0.005

 

• 樣品測定

 

• 移取800微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升待測樣品（注意：建議總量2微克線粒體蛋白）
• 上下傾倒數次，混勻
• 室溫下孵育3分鐘
• 加入100微升含有反應液（Reagent B）和穩定液（Reagent D）的反應工作液
• 即刻上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（0秒讀數－60秒讀數），通常活性讀數差值為正數

 

• 計算樣品活性

 

【（樣品讀數－背景讀數）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數】÷【0.1（樣品容量；毫升）X 21.84（毫摩爾吸光系數 X 1（反應時間；分鐘）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾細胞色素C/分鐘

 

注意事項

 

• 本產品為20次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 線粒體樣品中忌用DTT和巰基乙醇等處理
• 線粒體樣品檢測前，須溶解；建議凍存融解（－70℃至37℃）循環3次
• 如果增強酶活檢測，建議使用線粒體復合物待測樣品預處理試劑盒－10342
• 每增加1個樣品，增加反應工作液為：反應液（Reagent B）100微升＋穩定工作液3微升，以此類推。配制反應工作液時，須根據樣本數量配制實際工作液容量
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 分光光度計波長嚴格設置在550nm，誤差10nm將不產生信號
• 加樣后3秒內進行比色測定
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 比色皿背景空對照0秒讀數通常大于0.2為理想狀態；建議使用比色皿測定
• 背景空對照的正常讀數差值（0秒－60秒）通常為0.001至0.005（正負即可）
• 樣品0秒讀數通常和背景空對照0秒讀數一致
• 樣本測定60秒讀數低于0秒讀數表明具有酶活性
• 線粒體呼吸鏈復合物IV酶活性單位濃度定義：在25℃室溫下，pH 7.0的情況下，每單位酶在單位時間內（每分鐘）氧化1微摩爾的細胞色素C
• 建議待測樣本為線粒體裂解懸液，則蛋白濃度為2微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供線粒體溶解試劑盒10018為后續的線粒體蛋白濃度測定的預處理試劑盒和 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果使用細胞或組織裂解懸液，則蛋白濃度為50微克/100微升
• 本公司提供系列線粒體研究產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感

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