血液乳酸脫氫酶總活性酶動力比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

血液乳酸脫氫酶（LDH）總活性酶動力比色法定量檢測試劑是一種旨在通過乳酸脫氫酶反應系統中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的變化，即采用比色法來測定血液樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物和人體血液樣品（血漿、血清、血小板等）乳酸脫氫酶（LDH）的總活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

 

技術背景

 

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH；EC 1.1.1.27）是一種氧化還原酶，催化丙酮酸和乳酸的互相轉化反應。乳酸脫氫酶由4個亞單位構成，有兩種類型：肌肉型和心肌型。根據其亞單位成分，分為5種同功酶。乳酸脫氫酶的活性檢測用來評價細胞或組織的損害狀況。基于丙酮酸底物在乳酸脫氫酶的催化下，轉化成乳酸，同時還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），在分光光度儀下產生吸光峰值的變化（340nm 波長），由此定量測定乳酸脫氫酶的活性。乳酸脫氫酶反應系統為：

 

lactate dehydrogenase

Pyruvate  +  NADH       →      lactate  +  NAD⁺

         （高吸收峰） （低吸收峰）

 

產品內容

 

裂解液（Reagent A）    20毫升

緩沖液（Reagent B）  20毫升

反應液（Reagent C）     2毫升

底色液（Reagent D）   2毫升

陰性液（Reagent E）   500微升

產品說明書      1份

 

保存方式

 

保存反應液（Reagent C）和底色液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，底色液（Reagent D）避免光照，有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于用于樣品操作的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品制備

比色皿或96孔板：用于比色分析的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

 

實驗步驟

 

• 樣品準備

 

選擇一：血漿樣品

• 準備好肝素、ACD或EDTA等抗凝管
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• 即刻置于冰槽里備用或放進－70℃冰箱里保存
• （選擇步驟）移取10微升進行蛋白定量測定 （注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）

 

選擇二：血清樣品

1． 準備好不含抗凝劑的儲存管 

• 抽取1毫升血液，置于儲存管里
• 室溫下，靜置30分鐘，直至血液凝結
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血清成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• 即刻置于冰槽里備用或放進－70℃冰箱里保存
• （選擇步驟）移取10微升進行蛋白定量測定 （注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）

 

選擇三：血小板樣品

• 準備好肝素抗凝管
• 抽取5毫升血液，置于抗凝管里
• 轉移到15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為200g（或1000RPM，例如eppendorf 5815）
• 小心移取上清液到新的15毫升離心管
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為2000g（或3500RPM，例如eppendorf 5815）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升裂解液（Reagent A），混勻
• 渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 轉移到1.5毫升離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
• 即刻置于冰槽里備用或放進－70℃冰箱里保存
• （選擇步驟）移取10微升進行蛋白定量測定 （注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1） 

 

選擇四：紅細胞樣品

• 準備好肝素、ACD或EDTA等抗凝管
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 轉移到15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為200g（或1000RPM，例如eppendorf 5815）
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升用戶自備的紅細胞緩沖液，混勻
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為2000g（或3500RPM，例如eppendorf 5815）
• 小心抽去上清液
• 重復實驗步驟6至8二次
• 加入5毫升用戶自備的紅細胞裂解液
• 放進37℃恒溫水槽，孵育10分鐘
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為2000g（或3500RPM，例如eppendorf 5815）
• 小心移取上清液到新的15毫升離心管
• 即刻置于冰槽里備用或放進－70℃冰箱里保存
  • （選擇步驟）移取10微升進行蛋白定量測定 （注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）

 

二、測定準備

 

• 準備好待測樣品（例如血清樣品等），置于冰槽里
• 設定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長340nm，間隔30秒，讀數7次（共3分鐘），并置零或設置0分鐘和1分鐘各測讀1次
• 緩沖液（Reagent B）室溫下均衡溫度

 

三、背景對照測定

 

• 移取780微升緩沖液（Reagent B）到新的比色皿
• 加入100微升反應液（Reagent C）
• 加入100微升底色液（Reagent D）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在25℃溫度下孵育5分鐘
• 加入20微升陰性液（Reagent E）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（0分鐘讀數－1分鐘讀數或3分鐘讀數），正常讀數差值為0.001至0.005

 

• 樣品測定

 

• 移取780微升緩沖液（Reagent B）到新的比色皿
• 加入100微升反應液（Reagent C）
• 加入100微升底色液（Reagent D）
• 上下傾倒數次，混勻
• 在25℃溫度下孵育5分鐘
• 加入20微升待測樣品（20微克蛋白）（注意：樣品須清澈，且pH為7.5）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（0分鐘讀數－1分鐘讀數或3分鐘讀數），通常活性讀數差值為正數

 

五、計算樣品活性

 

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 1（體系容量；毫升）]÷[0.02（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數）X 1或3（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾丙酮酸/分鐘

 

六、酶標儀測定

 

• 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取195微升緩沖液（Reagent B）到相應孔里
• 分別加入25微升反應液（Reagent C）
• 分別加入25微升底色液（Reagent D）
• 輕輕搖動96孔板
• 在25℃溫度下孵育5分鐘
• 分別加入5微升陰性液（Reagent E）或待測樣品（10微克蛋白）（注意：樣品須清澈，且pH為7.5）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測，包括（0分鐘初始讀數和1分鐘讀數或3分鐘讀數）
• 活性計算

 

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數）X 0.6（光徑距離；厘米）X 1或3（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾丙酮酸/分鐘

 

注意事項

 

• 本產品為20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，至關重要 
• 加樣后3秒內比色測定
• 反應1分鐘后比色測定值趨于穩定；測定值由高到低變化；測定可持續3分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 背景空對照0分鐘讀數通常0.2至0.8為理想狀態
• 背景空對照的正常讀數差值（0分鐘－1分鐘）通常為0.001至0.005（正負即可）
• 樣品0分鐘讀數通常和背景空對照0分鐘讀數一致
• 樣本測定1分鐘讀數低于0分鐘讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為20微克/20微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 乳酸脫氫酶單位活性定義為：在25℃，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠轉化1微摩爾丙酮酸至乳酸所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列乳酸脫氫酶檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感

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