活體細(xì)胞半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）活性原位熒光染色檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書（中文版）

 

主要用途

 

活體細(xì)胞半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）活性原位熒光染色檢測試劑是一種旨在通過半胱氨酸蛋白酶-3抑制劑DEVD-FMK，與熒光染料FITC偶聯(lián)作為探針，自由進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，不可逆地結(jié)合活化的半胱氨酸蛋白酶-3，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明酶活性的變化，進(jìn)而分析細(xì)胞凋亡的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物細(xì)胞的半胱氨酸蛋白酶-3活性檢測。可以被用于細(xì)胞凋亡、信號傳遞等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，活體檢測，操作簡易，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞遵循特定程序的自殺，一種進(jìn)化保留的形式。其程序的主要元素是蛋白水解酶，即半胱氨酸蛋白酶的瀑布式反應(yīng)：從激發(fā)凋亡信號，到酶的裂解活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞瓦解。半胱氨酸蛋白酶家屬是絲氨酸蛋白水解酶，其活化的酶由2個20Kd的大單體和2個10Kd的小單體組成2個異構(gòu)二聚體。半胱氨酸蛋白酶家屬分成三大分支：啟動、擴(kuò)增和執(zhí)行。受體激活酶的啟動，例如半胱氨酸蛋白酶-8（caspase-8）；啟動性酶或線粒體分子激活擴(kuò)增反應(yīng)，例如半胱氨酸蛋白酶-9（caspase-9）；最后上游的酶激活下游的酶執(zhí)行，例如半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）。半胱氨酸蛋白酶特異性地識別目標(biāo)底物的4個氨基酸殘基，包括天門冬氨酸。使用熒光標(biāo)記的特異性底物可以探測半胱氨酸蛋白酶活性。綠色熒光標(biāo)記的抑制劑，F(xiàn)ITC-DEVD- FMK，是天冬氨酰-谷氨酰-纈氨酰-天冬氨酸（Aspaspartatylglutamyl valylaspartic acid；DEVD）熒光甲基酮（fluoromethyl ketone；FMK）的異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocynate；FITC）衍生物。該抑制劑進(jìn)入細(xì)胞后，與活化半胱氨酸蛋白酶的大單體上絲氨酸殘基二價共鍵結(jié)合，抑制半胱氨酸蛋白酶-3的活性，而未結(jié)合的熒光標(biāo)記彌散出胞外被洗脫。含有熒光標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行熒光定性或定量檢測。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

染色液（Reagent A）     20微升

稀釋液（Reagent B）      2毫升

清理液（Reagent C）    100毫升

固著液（Reagent D）     10毫升

產(chǎn)品說明書 1份

 

保存方式

 

保存染色液（Reagent A）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；染色液（Reagent A）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細(xì)胞脫離

完全細(xì)胞培養(yǎng)液（12052）：用于細(xì)胞脫落收集

1.5毫升離心管：用于活體細(xì)胞染色的容器

（微型）臺式離心機(jī)：用于細(xì)胞收集的操作

比色皿：用于熒光定量的容器

熒光顯微鏡：用于活體細(xì)胞熒光定性分析

熒光分光光度計：用于活體細(xì)胞熒光定量分析

細(xì)胞流式儀：用于活體細(xì)胞熒光分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent B）室溫下預(yù)熱。然后移出2微升染色液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管，加入200微升稀釋液（Reagent B），混勻后，在冰槽里靜置，并標(biāo)記為染色工作液，放在暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 直接法

 

• 準(zhǔn)備1個12孔細(xì)胞培養(yǎng)板（內(nèi)置蓋玻片）的待測細(xì)胞，每孔鋪滿率達(dá)70％（約30萬細(xì)胞數(shù)）
• 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
• 輕輕沿著孔壁加入1毫升 清理液（Reagent C）到細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 小心抽去 清理液（Reagent C） 
• 加入100微升含有染色液（Reagent A） 和稀釋液（Reagent B）的染色工作液在蓋玻片上
• 室溫下（25℃），孵育20分鐘，注意避光
• 小心抽去100微升染色工作液
• 小心加入1毫升清理液（Reagent C） 
• 小心抽去 清理液（Reagent C）
• 小心加入500微升固著液（Reagent D）
• 室溫下（25℃），孵育30分鐘
• 小心抽去固著液（Reagent D）
• 小心加入1毫升清理液（Reagent C） 
• 小心抽去 清理液（Reagent C）
• 小心加入500微升清理液（Reagent C）
• 即刻在共聚焦或倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察 ：濾波器激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長530nm ――如果綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，表明半胱氨酸蛋白酶-3活性增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡陽性

 

• 間接法

 

• 準(zhǔn)備1個12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的待測細(xì)胞，每孔鋪滿率達(dá)70％（約30萬細(xì)胞數(shù)）
• 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液  
• 加入1毫升 清理液（Reagent C）到細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 小心抽去1毫升 清理液（Reagent C） 
• 加入500微升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養(yǎng)孔表面
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育1分種
• 手擊震動培養(yǎng)板，使細(xì)胞脫落
• 加入1毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入100微升含有染色液（Reagent A）和稀釋液（Reagent B）的染色工作液
• 用200微升槍頭上下輕柔抽吸，混勻細(xì)胞顆粒群
• 轉(zhuǎn)入到1.5毫升離心管或細(xì)胞流式儀專用測試管
• 室溫下（25℃），孵育20分鐘，注意避光
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升清理液（Reagent C），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升固著液（Reagent D），混勻細(xì)胞顆粒群
• 室溫下（25℃），孵育30分鐘
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升清理液（Reagent C），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入100微升清理液（Reagent C），混勻細(xì)胞顆粒群

 

選擇一、（共聚焦）熒光顯微鏡觀察 

• 混勻后，移出50微升在載玻片上
• 即刻進(jìn)行載玻片壓片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察 ：濾波器激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長530nm ――如果綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，表明半胱氨酸蛋白酶-3活性增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡陽性

 

選擇二、細(xì)胞流式儀分析

• 混勻后，即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析：使用FL1，激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長530nm，觀察50000個細(xì)胞以上
• 構(gòu)建柱狀圖/直方圖（Histogram）：log FL1為X軸，細(xì)胞數(shù)為Y軸――陰性細(xì)胞或峰形處于FL1的第一個log位置，陽性細(xì)胞處于第一個峰形右側(cè)的峰形

 

選擇三、熒光分光光度計測定

• 混勻后，移出100微升到黑色96孔板里或100微升比色皿里
• 即刻進(jìn)行熒光分光光度儀測定：激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長530nm，獲得相對熒光單位（RFU）――RFU值高表明半胱氨酸蛋白酶-3活性增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡陽性

 

注意事項

 

• 本產(chǎn)品為20次（0.1毫升工作液）操作
• 所有操作均須無菌狀態(tài)下進(jìn)行
• 操作時，須戴手套
• 待測細(xì)胞建議不要過于饑餓或過度生長
• 建議使用正常細(xì)胞作為陰性對照，顯示微弱的背景信號
• 建議細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測分析，最遲不得超過24小時
• 孵育時，必須避免光照
• 建議使用黑色96孔板進(jìn)行熒光定量分析
• 本公司提供系列半胱氨酸蛋白酶熒光染色分析試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰

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