植物細胞可溶性總核蛋白高純制備試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

植物細胞可溶性總核蛋白高純制備試劑是一種旨在使用物理和化學方法快速充分裂解細胞，并在蛋白酶抑制混合劑的幫助下，充分溶解細胞，然后通過差速和密度離心，收集所有高度純化的細胞核內可溶性蛋白質的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種新鮮植物細胞，包括擬南芥、煙草培養細胞等樣品。可直接用于轉錄因子動態監測、核酸蛋白結合凝膠遷移電泳分析（EMSA）、特定核蛋白后續純化、蛋白電泳、西方雜交、免疫抗體和質譜分析等。產品即到即用，性能穩定，操作便捷，收集效果好。

技術背景

通過特殊裂解液和蛋白酶抑制混合劑可以防止裂解后細胞核內各種活性蛋白成分遭到活化的內源性蛋白酶的破壞，充分保留細胞核內蛋白質的免疫和生物學活性。同時通過等密度離心獲得純度更高的細胞核蛋白。

產品內容

清理液（Reagent A）      30毫升

胞解液（Reagent B） 10毫升

活性液（Reagent C）      80微升

高純液A（Reagent D） 20毫升

高純液B（Reagent E） 27毫升

裂解液（Reagent F）  5毫升

產品說明書  1份

保存方式

保存胞解液（Reagent B）、活性液（Reagent C）和裂解液（Reagent F）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

離心管：用于等密度離心的容器

4℃（微型）臺式離心機：用于樣品操作

DOUNCE勻漿器：用于細胞裂解

實驗步驟

實驗開始前，將試劑盒里的試劑從－20℃的冰箱里取出，放進冰槽里凍融。然后進行下列操作。

• 準備好植物培養細胞（5 X 10⁷細胞總量）
• 轉移到15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A），混勻
• （選擇步驟）放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為3000g
• （選擇步驟）小心抽去清理液
• 加入1毫升預冷的胞解液（Reagent B） 
• 加入5微升活性液（Reagent C）
• 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用研磨棒勻化細胞（約80下） 
• 小心移取勻漿液到新的1.5毫升離心管
• 即刻放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液（注意：如果需要制備胞漿總蛋白，保存上清液至－70℃的冰箱里備用）
• 加入500微升預冷的清理液（Reagent A），混勻顆粒群
• 準備1個6毫升離心管
• 加入2毫升高純液A（Reagent D）（注意：使用前搖勻高純液A(Reagent D)）
• 輕輕加入2.7毫升高純液B（Reagent E）在高純液A（Reagent D）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液B(Reagent E)）
• 輕輕加入500微升上述細胞核懸液在高純液B（Reagent E）的上面，避免震動
• 即刻放進4℃臺式離心機離心30分鐘，速度為1000g
• 小心取出離心管：可見下端液相交界處的致密棕黃色樣品帶（注意：在其上端可能有淺色胞漿樣品帶） 
• 小心抽去細胞核樣品帶以上的無關液體
• 小心收集200微升細胞核樣品帶到2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純細胞核樣品帶
• 加入500微升預冷裂解液（Reagent F）
• 加入2.5微升活性液（Reagent D） 
• 強力渦旋震蕩15秒
• 放進冰槽里孵育30至60分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩15秒一次
• 即刻放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415D）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
• 放進－70℃的冰箱里備用
• 或放進冰槽里，繼續后續操作

注意事項

• 本產品為10次操作
• 所有操作均須在4℃狀態下進行
• 操作時須戴手套
• 建議一次操作的細胞總量為5 X 10⁷
• 建議使用新鮮或凍存保護良好的植物細胞
• 本產品所獲得的細胞核蛋白純度（可達到99％）和產量最為理想
• 使用高純液A（Reagent D）和高純液B（Reagent E）前，須搖勻后加入；并注意避免污染母液
• 根據離心管的大小，按比例調整高純液A（Reagent D）和高純液B（Reagent E）的使用量
• 5 X 10⁷細胞通常可以獲得1毫克可溶性總核蛋白
• 如果放在－70℃冰箱里儲存備用，避免反復凍融
• 本公司提供系列植物細胞分析試劑產品
    

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定無蛋白酶污染

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