細胞可溶性膜蛋白相位分離制備試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

細胞可溶性膜蛋白相位分離制備試劑是一種旨在使用物理或化學方法快速充分裂解細胞，并在蛋白酶抑制混合劑的幫助下，通過差速離心和表面活性劑，分離和收集所有高純可溶性細胞膜蛋白質（完整蛋白和跨膜蛋白以及膜相關蛋白等）的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞（動物、人體）等樣品。可直接用于特定蛋白后續純化、酶譜分析、二維蛋白電泳、西方雜交、免疫沉淀、功能鑒定和質譜分析以及蛋白組學研究等。產品即到即用，性能穩定，操作便捷，收集效果顯著。

技術背景

通過物理勻漿和化學裂解以及蛋白酶抑制混合劑的共同作用，防止裂解后細胞內各種活性蛋白成分遭到活化的內源性蛋白酶的破壞，充分保留細胞內蛋白質的免疫和生物學活性，同時使用表面活性劑，確保膜蛋白（完整蛋白integral protein和跨膜蛋白transmembrane protein）的高產、高純、高溶。

產品內容

清理液（Reagent A） 100毫升

裂解液（Reagent B） 100毫升

活性液（Reagent C） 100微升

強化液（Reagent D）   8毫升

分離液（Reagent E）  20毫升

產品說明書   1份

保存方式

保存活性液（Reagent C）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

PBS緩沖溶液（12033）：用于清理細胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細胞脫離

完全細胞培養液（12052）：用于細胞處理所需的培養基

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

4℃（微型）臺式離心機：用于樣品細胞收集操作

組織勻漿器：用于細胞裂解

恒溫水槽：用于樣品孵育

實驗步驟

實驗開始前，將試劑盒里的活性液（Reagent C）從－20℃的冰箱里取出，置入冰槽里凍融，然后移出4毫升裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管，加入5微升活性液（Reagent C），充分混勻，置于冰槽里，標記為裂解工作液。然后進行下列操作。

一、細胞勻漿法

• 準備5至10瓶75cm²細胞培養瓶的細胞（5 X 10⁷），直至細胞生長鋪滿整個培養表面
• 分別加入10毫升用戶自備的PBS緩沖溶液到每個細胞培養瓶，覆蓋培養瓶表面，然后抽去
• 分別加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
• 置入37℃培養箱3分種
• 振動培養瓶，使細胞脫落，然后分別加入10毫升用戶自備的完全細胞培養液
• 合并移入到一個50毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞樣品從這一步驟開始）
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升預冷的清理液（Reagent A），混勻細胞
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入4毫升預冷的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群
• 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化細胞（約80下） 
• 將所有細胞勻漿物移入到預冷的15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到新的預冷的15毫升錐形離心管
• 加入1毫升預冷的裂解液（Reagent B）到含有沉淀顆粒群的15毫升錐形離心管
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻裂解顆粒群
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液合并到上述預冷的15毫升錐形離心管（扔掉沉淀顆粒）
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為15000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒
• 加入1毫升分離液（Reagent E），混勻顆粒群
• 置于冰槽里孵育15分鐘，期間每隔5分鐘用手搖動混勻一次
• 轉移到1.5毫升離心管
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g（或10000RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
• 放進37℃恒溫水槽孵育10分鐘（注意：可見液體混濁）
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心移取上層液相液體到新的1.5毫升離心管
• 放進－70℃冰箱里
• 或放進冰槽里，繼續后續（蛋白定量、西方雜交、免疫沉淀等）操作

二、化學處理法

• 準備5至10瓶75cm²細胞培養瓶的細胞（5 X 10⁷），直至細胞生長鋪滿整個培養表面
• 分別加入10毫升用戶自備的PBS緩沖溶液到每個細胞培養瓶，覆蓋培養瓶表面，然后抽去
• 分別加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
• 置入37℃培養箱3分種
• 振動培養瓶，使細胞脫落，然后分別加入10毫升用戶自備的完全細胞培養液
• 移入到一個50毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞樣品從這一步驟開始）
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升預冷的清理液（Reagent A）
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入4毫升預冷的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入400微升預冷的強化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次 
• 轉移到新的預冷的15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管
• 加入1毫升預冷的裂解液（Reagent B）到含有沉淀顆粒群的15毫升錐形離心管
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻裂解顆粒群

• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移出上清液合并到上述預冷的15毫升錐形離心管（扔掉沉淀顆粒）
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為15000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒
• 加入1毫升分離液（Reagent E），混勻顆粒群
• 置于冰槽里孵育15分鐘，期間每隔5分鐘用手搖動混勻一次
• 轉移到1.5毫升離心管
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g（或10000RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管
• 放進37℃恒溫水槽孵育10分鐘（注意：可見液體混濁）
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心移取上層液相液體到新的1.5毫升離心管
• 放進－70℃冰箱里
• 或放進冰槽里，繼續后續（蛋白定量、西方雜交、免疫沉淀等）操作

注意事項

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 待測細胞樣品為5 X 10⁷細胞，約1克細胞重量
• 根據細胞量的不同，按比例調整試劑用量
• 所有操作均須在4℃狀態下進行
• 對于難以裂解的細胞，采用物理勻漿法是優先推薦的技術處理
• 用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現發亮的圓環。低于80％可以增加勻化次數或孵育時間
• 通常5 X 10⁷細胞可獲得10至100微克細胞膜蛋白
• 制備產物如果放在－70℃冰箱里儲存備用，避免反復凍融
• 本公司提供系列蛋白制備試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定無蛋白酶污染

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