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全血線粒體可溶性總蛋白制備試劑盒產品說明書（中文版）
主要用途
全血線粒體可溶性總蛋白制備試劑是一種旨在通過化學溶解以純化血白細胞、物理或化學破膜及離心處理分離出完整而純化的線粒體細胞器，并在蛋白酶抑制混合劑的幫助下，使已純化的線粒體膜結構破裂而獲得線粒體內活性蛋白酶系統的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物血細胞中的線粒體可溶性總蛋白的制備。可以被用于細胞凋亡、信號傳遞、代謝和營養學等的研究。可直接用于特定蛋白后續純化、蛋白一維或二維電泳、西方雜交、免疫抗體和質譜分析等等。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。
技術背景
線粒體是細胞中重要的細胞器，其主要功能是提供細胞內各種物質代謝所需要的能量。線粒體中含有豐富的細胞色素氧化酶系統和細胞凋亡相關蛋白等。通過機械或化學方法破裂細胞，進而差速離心獲得線粒體，然后通過特殊裂解液和蛋白酶抑制混合劑防止裂解后線粒體內各種活性蛋白成分遭到活化的內源性蛋白酶的破壞，充分保留線粒體內蛋白質的免疫和生物學活性，最后進行相關蛋白的獨立分析。
產品內容
血溶液（Reagent A） 2 X 500毫升
清理液（Reagent B） 600毫升
裂解液（Reagent C） 80毫升
凈化液（Reagent D） 20毫升
強化液（Reagent E） 10毫升
保存液（Reagent F） 200毫升
破膜液（Reagent G） 2毫升
活性液（Reagent H） 20微升
上樣液（Reagent I） 3毫升
產品說明書 1份
保存方式
保存凈化液（Reagent D）和活性液（Reagent H）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
渦旋震蕩儀：用于混勻
4℃（微型）臺式離心機：用于樣品操作
4℃超速離心機：用于樣品操作
DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞
實驗步驟
- 白細胞分離
實驗開始前，室溫預熱的血溶液（Reagent A），同時4℃預冷清理液（Reagent B）。然后進行下列操作。
- 準備2個無菌的50毫升錐形離心管
- 輕輕混勻新鮮的EDTA等抗凝的全血樣品
- 分別移出5毫升全血樣品到每個50毫升錐形離心管
- 分別加入25毫升室溫預熱的血溶液（Reagent A）
- 輕輕上下傾倒離心管5次，確保充分混勻
- 室溫下（25℃）孵育4分鐘，期間輕輕上下傾倒離心管數次（注意：血液顏色可能由不透明紅色到清澈紅色的變化）
- 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
- 小心抽掉上清液，留下500微升液體，以防抽掉白細胞顆粒群
- 用手指輕彈離心管2至3下，使白細胞顆粒群松動
- 分別加入10毫升預冷的清理液（Reagent B），混勻細胞
- 2管50毫升錐形離心管合并為1管
- 放入臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
- 小心抽去上清液
- 加入10毫升預冷的清理液（Reagent B），混勻細胞
- 放入臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
- 小心抽去上清液，確保沒有液體殘留（注意：如果暫時停止操作，須暫時放進－70℃冰箱里）
- 白細胞線粒體總蛋白制備
實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent D）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent D）到4毫升的裂解液（Reagent C）里，混勻后，置入冰槽里，標記為裂解工作液。然后進行下列操作，根據用戶要求選擇其中一種方法：
方法一：細胞勻漿法
- 加入預冷的5毫升裂解工作液
- 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群
- 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
- 在冰槽里用勻漿幫勻化細胞（約20至40下）（注意：參見注意事項12）
- 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
- 放入4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
- 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
- 放入4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
- 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
- （選擇步驟）加入3毫升預冷的保存液（Reagent F）
- （選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心5分鐘，速度為10000g
- （選擇步驟）小心抽去上清液
- 加入100微升破膜液（Reagent G）到線粒體顆粒樣品中
- 加入1微升活性液（Reagent H）
- 渦旋震蕩15秒
- 置入冰槽中孵育15分鐘
- 渦旋震蕩60秒
- 放進微型臺式離心機離心2分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管――此為所有可溶性線粒體蛋白系統
- 若暫時不予后續處理，保存在－20℃冰箱里
- 繼續進行下列操作：
操作一、線粒體總蛋白定量檢測
1） 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
操作二、可溶性線粒體蛋白電泳
1） 移取20微升（1微克/微升）上清液到新的1.5毫升離心管
2） 加入20微升上樣液（Reagent I）
3） 渦旋震蕩15秒
- 放進微型臺式離心機離心10秒，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
- 煮沸5分鐘
- 上樣，進行電泳操作和西方雜交
方法二、化學處理法
- 加入預冷的5毫升裂解工作液
- 渦旋震蕩5秒，充分混勻
- 在冰槽里孵育2分鐘，其中每間隔一分鐘渦旋震蕩5秒
- 加入預冷的500微升強化液（Reagent E）
- 渦旋震蕩5秒，充分混勻
- 在冰槽里孵育5分鐘，其中每間隔一分鐘渦旋震蕩5秒（注意：參見注意事項13）
- 加入預冷的5毫升保存液（Reagent F），用手指輕彈混勻
- 放入4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
- 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
- 放入4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
- 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
- （選擇步驟）加入3毫升預冷的保存液（Reagent F）
- （選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心5分鐘，速度為10000g
- （選擇步驟）小心抽去上清液
- 加入100微升破膜液（Reagent G）到線粒體顆粒樣品中
- 加入1微升活性液（Reagent H）
- 渦旋震蕩15秒
- 置入冰槽中孵育15分鐘
- 渦旋震蕩60秒
- 放進微型臺式離心機離心2分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管――此為所有可溶性線粒體蛋白系統
- 若暫時不予后續處理，保存在－20℃冰箱里
- 繼續進行下列操作：
操作一、線粒體總蛋白定量檢測
1） 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
操作二、可溶性線粒體蛋白電泳
- 移取20微升（1微克/微升）上清液到新的1.5毫升離心管
- 加入20微升上樣液（Reagent I）
- 渦旋震蕩15秒
- 放進微型臺式離心機離心10秒，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
- 煮沸5分鐘
- 上樣，進行電泳操作和西方雜交
注意事項
- 本產品為20次（10毫升全血/次）操作
- 所有操作均須無菌狀態下進行
- 線粒體操作均須在4℃或以下狀態下進行
- 操作時，須戴手套
- 操作時，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）
- 建議使用足夠的樣品量
- 建議嚴格控制操作時間
- 建議使用新鮮全血
- 建議全血樣品和血溶液（Reagent A）充分混勻，否則造成血紅細胞的不完全溶解
- 建議全血樣品和血溶液（Reagent A）孵育時間5分鐘為佳，以防白細胞損害
- 每毫升全血平均可獲得2.5 X 106白細胞
- 通常勻化次數為20至40下（或細胞顆粒群消失為止）達到80％的細胞裂解為理想狀態，但不同的細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現發亮的圓環。低于50％可以增加勻化次數
- 通常孵育5分鐘（不宜超過5分鐘）達到80％的細胞裂解為理想狀態，但不同的細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現發亮的圓環。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數
- 通常1 X 107血白細胞的線粒體含量為100微克至1毫克線粒體蛋白
15． 本產品所獲得的線粒體純度和產量最為理想。通過調整10000g離心速度到3000至8000g，可以提高粗提的線粒體純化程度，但線粒體產量相應減少
- 如果需檢測不可溶性線粒體蛋白，可保留線粒體裂解后的沉淀物，直接加入10微升上樣液（Reagent I）和10微升無離子水，然后繼續操作二的步驟3至6
- 線粒體蛋白須放在－70℃冰箱里儲存備用，避免反復凍融
- 本公司提供系列線粒體試劑產品
質量標準
- 本產品經鑒定性能穩定
- 本產品經鑒定無蛋白酶污染
- 本產品經鑒定蛋白萃取產量高
- 本產品經鑒定純化程度高
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