真菌/酵母細(xì)胞線粒體可溶性總蛋白制備試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

 

主要用途

真菌/酵母細(xì)胞線粒體可溶性總蛋白制備試劑是一種旨在使用生物、化學(xué)和物理方法相結(jié)合，有效去除真菌/酵母菌細(xì)胞壁，進(jìn)一步快速且充分裂解真菌/酵母菌細(xì)胞，從而分離出完整而純化的線粒體細(xì)胞器，并在蛋白酶抑制混合劑的幫助下，使已純化的線粒體膜結(jié)構(gòu)破裂而獲得線粒體內(nèi)活性蛋白酶系統(tǒng)的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適合于各種新鮮培養(yǎng)或凍存的野生型或突變型真菌/酵母菌菌株細(xì)胞的線粒體可溶性總蛋白的制備。其制備物產(chǎn)量高，可以被用于細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、代謝和蛋白組學(xué)等研究。可直接用于特定蛋白后續(xù)純化、蛋白一維或二維電泳、西方雜交、免疫抗體和質(zhì)譜分析等等。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

線粒體是細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，其主要功能是提供細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)代謝所需要的能量。線粒體中含有豐富的細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白等。通過機(jī)械或化學(xué)方法破裂細(xì)胞，進(jìn)而差速離心獲得線粒體，然后通過特殊裂解液和蛋白酶抑制混合劑防止裂解后線粒體內(nèi)各種活性蛋白成分遭到活化的內(nèi)源性蛋白酶的破壞，充分保留線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫和生物學(xué)活性，最后進(jìn)行相關(guān)蛋白的獨(dú)立分析。 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）        500毫升

平衡液（Reagent B）   500毫升

酶解液（Reagent C）     1毫升

裂解液（Reagent D）         80毫升

凈化液（Reagent E）    20毫升

強(qiáng)化液（Reagent F）    10毫升

保存液（Reagent G）   200毫升

破膜液（Reagent H）         2毫升

活性液（Reagent I）    20微升

上樣液（Reagent J）    3毫升

產(chǎn)品說明書     1份

 

保存方式

 

保存酶解液（Reagent C）、凈化液（Reagent E）和活性液（Reagent I）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，嚴(yán)格避免污染；有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于線粒體初步制備物的存放

50毫升錐形離心管：用于細(xì)胞收集后離心或清洗

1.5毫升離心管：用于保存線粒體

4℃臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞

4℃臺(tái)式高速離心機(jī)：用于分離細(xì)胞器成分

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)物

DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent E）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent E）到4毫升的裂解液（Reagent D）里，混勻后，置入冰槽里，標(biāo)記為裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 準(zhǔn)備好50毫升新鮮真菌/酵母菌樣品
• 在分光光度儀上測OD600＝1.0（1 OD＝1 X 10⁷細(xì)胞/毫升；總量為5 X 10⁸細(xì)胞） 
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入25毫升清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入2毫升平衡液（Reagent B），混勻
• 加入50微升酶解液（Reagent C），混勻
• 放進(jìn)30℃恒溫水槽孵育60分鐘，期間每隔15分鐘輕輕用手搖勻
• 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升平衡液（Reagent B），混勻
• 放進(jìn)30℃恒溫水槽孵育30分鐘，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟21
• 同時(shí)將平衡液（Reagent B）置入冰槽里預(yù)冷30分鐘（注意：以下步驟在4℃環(huán)境下進(jìn)行）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升預(yù)冷的平衡液（Reagent B），混勻
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升含有裂解液（Reagent D）和凈化液（Reagent E）的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細(xì)胞顆粒群
• 選擇下列其中一種方法：

 

方法一：物理處理法

• 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿幫勻化細(xì)胞（約20下）（注意：參見注意事項(xiàng)10）
• 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式高速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• （選擇步驟）加入3毫升預(yù)冷的保存液（Reagent G）
• （選擇步驟）放進(jìn)4℃臺(tái)式高速離心機(jī)再次離心5分鐘，速度為10000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入100微升破膜液（Reagent H）到線粒體顆粒樣品中
• 加入1微升活性液（Reagent I）
• 渦旋震蕩15秒
• 置入冰槽中孵育15分鐘
• 渦旋震蕩60秒
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管――此為所有可溶性線粒體蛋白系統(tǒng)
• 若暫時(shí)不予后續(xù)處理，保存在－20℃冰箱里
• 繼續(xù)進(jìn)行下列操作：

 

操作一、線粒體總蛋白定量檢測

1） 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

 

操作二、可溶性線粒體蛋白電泳

1） 移取20微升（1微克/微升）上清液到新的1.5毫升離心管

2） 加入20微升上樣液（Reagent J）

3） 渦旋震蕩15秒

• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10秒，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 煮沸5分鐘

6） 上樣，進(jìn)行電泳操作和西方雜交

 

方法二：化學(xué)處理法

• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入500微升預(yù)冷的強(qiáng)化液（Reagent F）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項(xiàng)11）
• 加入5毫升預(yù)冷的保存液（Reagent G），輕輕搖動(dòng)試管混勻
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式高速離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• （選擇步驟）加入3毫升預(yù)冷的保存液（Reagent G）
• （選擇步驟）放進(jìn)4℃臺(tái)式高速離心機(jī)再次離心5分鐘，速度為10000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入100微升破膜液（Reagent H）到線粒體顆粒樣品中
• 加入1微升活性液（Reagent I）
• 渦旋震蕩15秒
• 置入冰槽中孵育15分鐘
• 渦旋震蕩60秒
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管――此為所有可溶性線粒體蛋白系統(tǒng)
• 若暫時(shí)不予后續(xù)處理，保存在－20℃冰箱里
• 繼續(xù)進(jìn)行下列操作：

 

操作一、線粒體總蛋白定量檢測

1） 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

 

操作二、可溶性線粒體蛋白電泳

• 移取20微升（1微克/微升）上清液到新的1.5毫升離心管
• 加入20微升上樣液（Reagent J）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10秒，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 煮沸5分鐘
• 上樣，進(jìn)行電泳操作和西方雜交

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次操作（50毫升菌液：1克細(xì)胞濕重或5 X 10⁸細(xì)胞）
• 其它實(shí)際操作的細(xì)胞量與試劑使用量按比例調(diào)整：例如10毫升菌液（OD600=1）：試劑用量是標(biāo)準(zhǔn)用量的五分之一
• 操作時(shí)，須戴手套
• 操作時(shí)，避免污染母液
• 50毫升（OD600＝1）菌液濕重約1克
• 細(xì)胞生長條件影響線粒體的質(zhì)量：建議在有氧條件下富含葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)
• 實(shí)驗(yàn)步驟20以下的所有操作均須在4℃或以下狀態(tài)下進(jìn)行
• 建議使用足夠的細(xì)胞量
• 建議嚴(yán)格控制操作時(shí)間
• 通常勻化次數(shù)為20下（或細(xì)胞顆粒群消失為止）達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同菌株的細(xì)胞會(huì)存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
• 通常孵育5分鐘達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同菌株的細(xì)胞會(huì)存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時(shí)間和渦旋震蕩次數(shù)
• 通常1克細(xì)胞濕重或5 X 10⁸細(xì)胞的線粒體含量為50微克線粒體蛋白，但不同菌株或培養(yǎng)條件會(huì)存在差異；建議使用純化線粒體蛋白質(zhì)濃度定量測定試劑盒（10059）測定線粒體蛋白濃度

13． 制備產(chǎn)物如果放在－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆茫瑖?yán)格避免反復(fù)凍融

• 如果需檢測不可溶性線粒體蛋白，可保留線粒體裂解后的沉淀物，直接加入10微升上樣液（Reagent H）和10微升無離子水，然后繼續(xù)操作二的步驟3至6
• 線粒體蛋白須放在－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆茫�避免反�?fù)凍融
• 本公司提供系列真菌/酵母細(xì)胞線粒體試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無蛋白酶污染
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定蛋白萃取產(chǎn)量高
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定純化程度高

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