BCA蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

 

主要用途

 BCA蛋白質(zhì)濃度定量試劑是一種旨在使用二羧基二喹啉（Bicinchoninic acid）特異性鰲合與蛋白質(zhì)結(jié)合的銅離子，產(chǎn)生紫色反應(yīng)物，通過(guò)比色測(cè)定其最大光吸收來(lái)定量蛋白質(zhì)濃度的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種蛋白質(zhì)（動(dòng)物、人體、植物、微生物等）的含量檢測(cè)，尤其適合于含有各種去垢劑處理的蛋白質(zhì)樣品。產(chǎn)品即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，檢測(cè)敏感，定量精確。

 

技術(shù)背景

 

在堿性條件下，蛋白質(zhì)可以將二價(jià)銅還原為一價(jià)銅（此為biuret反應(yīng)），然后兩個(gè)二羧基二喹啉或二辛可寧酸（Bicinchoninic acid；BCA）分子選擇性地鰲合一個(gè)分子的一價(jià)銅，產(chǎn)生水溶性紫色復(fù)合物，在562nm波長(zhǎng)顯示高度敏感的最大光吸收，以定量蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、肽鍵的數(shù)量、氨基酸性質(zhì)（半胱氨酸、胱氨酸、色胺酸和酪氨酸）與色彩形成有關(guān)。其蛋白濃度和吸光值成線性正相關(guān)。該方法的最大優(yōu)點(diǎn)在于不受樣品中各種去垢化學(xué)成分的干擾。 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

反應(yīng)液（Reagent A）   22毫升

顯色液（Reagent B）  500微升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent C）      2毫升

補(bǔ)充液（Reagent D）    10毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)      1份

 

保存方式

 

保存標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent A），避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于反應(yīng)工作液配制的容器

96孔板：用于標(biāo)準(zhǔn)樣配制和樣品比色的容器

3毫升比色皿或玻璃管：用于樣品比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，移取5毫升反應(yīng)液（Reagent A）到新的15毫升錐形離心管，加入100微升顯色液（Reagent B），混勻后，標(biāo)記為反應(yīng)工作液，避免光照。然后將－20℃冰箱里試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent C）和待測(cè)樣品置入冰槽里融化。

 

A．標(biāo)準(zhǔn)樣品配制

1．準(zhǔn)備1個(gè)96孔板，做好相應(yīng)的標(biāo)記

2．按下表配制標(biāo)準(zhǔn)樣品反應(yīng)液

1）分別移取適量的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent C）到96孔板里指定序號(hào)的樣品孔里

2）分別移取適量的補(bǔ)充液（Reagent D）到96孔板里指定序號(hào)的樣品孔里

序號(hào)	標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent C）	補(bǔ)充液（Reagent D）	標(biāo)準(zhǔn)樣品蛋白質(zhì)終濃度（微克/毫升）
1	100微升	0微升	1000
2	150微升	50微升	750
3	100微升	100微升	500
4	50微升	150微升	250
5	20微升	140微升	125
6	4微升	156微升	25
7	0	100微升	0（背景空對(duì)照）

3．輕輕搖動(dòng)96孔板，混勻反應(yīng)物

4．置于4℃溫度下等待待測(cè)樣品準(zhǔn)備工作（如果樣品已經(jīng)就緒，則直接進(jìn)行下列操作）

 

B．標(biāo)準(zhǔn)樣和待測(cè)樣品96孔板微量測(cè)定

• 分別移取20微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)樣和待測(cè)樣品到96孔板里指定序號(hào)的樣品孔里
• 分別移取200微升含有反應(yīng)液（Reagent A）和顯色液（Reagent B）的反應(yīng)工作液到96孔板的樣品孔里
• 輕輕搖動(dòng)96孔板，混勻反應(yīng)物
• 37℃溫度下暗室里孵育30分鐘
• 置于室溫下冷卻5分鐘
• 即刻放進(jìn)分光光度酶標(biāo)儀里測(cè)定：波長(zhǎng)為562nm
• 實(shí)際讀數(shù)為（樣品讀數(shù)－無(wú)離子水空對(duì)照讀數(shù)）
• 繪制蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y）為吸光值OD562，橫座標(biāo)（X）為蛋白質(zhì)濃度（微克/毫升）
• 根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)出待測(cè)樣品的實(shí)際濃度

 

C．標(biāo)準(zhǔn)樣和待測(cè)樣品比色皿標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定

• 分別移取100微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)樣和待測(cè)樣品到3毫升比色皿或玻璃管里
• 分別移取2毫升含有反應(yīng)液（Reagent A）和顯色液（Reagent B）的反應(yīng)工作液
• 輕柔渦旋震蕩，混勻反應(yīng)物
• 37℃溫度下暗室里孵育30分鐘
• 置于室溫下冷卻5分鐘
• 即刻放進(jìn)分光光度儀里測(cè)定：波長(zhǎng)為562nm；置零
• 實(shí)際讀數(shù)為（樣品讀數(shù)－無(wú)離子水空對(duì)照讀數(shù)）
• 繪制蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y）為吸光值OD562，橫座標(biāo)（X）為蛋白質(zhì)濃度（微克/毫升）
• 根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)出待測(cè)樣品的實(shí)際濃度

 

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為100次操作（96孔板測(cè)定），10次操作（比色皿測(cè)定）包括額外10次標(biāo)準(zhǔn)樣96孔板測(cè)定
• 操作時(shí)，須戴手套
• 避免使用TX100處理樣品
• 反應(yīng)液（Reagent A）和顯色液（Reagent B）出現(xiàn)沉淀，可稍微加熱攪拌融解則可
• 反應(yīng)工作液配制時(shí)，會(huì)呈現(xiàn)渾濁，但混勻后很快變清，呈現(xiàn)綠色
• 反應(yīng)工作液配制后，可以在密閉狀態(tài)和室溫條件下，1周內(nèi)性能維持穩(wěn)定，但建議即配即用
• 建議使用恒溫水浴，孵育反應(yīng)物
• 測(cè)試敏感性取決于孵育條件：溫度和孵育時(shí)間；通常室溫下需孵育2小時(shí)
• 如果增加比色效果，可置于60℃溫度下，孵育30分鐘
• 反應(yīng)結(jié)束冷卻后，即刻進(jìn)行比色測(cè)定，否則反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行
• 反應(yīng)結(jié)束后，超過(guò)1小時(shí)，則比色結(jié)果不能采信
• 可以使用玻璃或聚苯乙烯比色皿
• 建議增加無(wú)離子水作為背景空對(duì)照
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
• 酸性樣品將會(huì)干擾比色檢測(cè)
• 下列化學(xué)成分和濃度范圍會(huì)干擾比色檢測(cè)：

Ammonium Sulfate 5％ Iron

Ascorbic Acid Lipids

Catecholamines Mercaptoethanol

Creatinine Melibiose

Cysteine Phenol Red

EGTA Sucrose 10 mM

Glycerol Tryptophan

Glucose 10 mM Tyrosine

Glycine 1 M Sodium Acetate 2 M

Hydrogen Peroxide Sodium Phosphate 1 M

Hydrazides Uric Acid

 

• 避免化學(xué)成分的干擾，建議使用透析處理
• 本公司提供系列蛋白定量檢測(cè)產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感

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