Bradford蛋白質濃度定量試劑盒產品說明書（中文版）

 

主要用途

Bradford蛋白質濃度定量試劑是一種旨在使用考馬斯亮藍染色劑G-250與可溶性蛋白質特異性結合產生色彩差異變化，通過比色測定其最大吸收轉換來定量蛋白質濃度的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種蛋白質（動物、人體、植物、微生物等）的含量檢測。產品即到即用，操作簡捷，性能穩定，檢測敏感，定量精確。

 

技術背景

 

考馬斯亮藍染料G-250（Coomassie Brilliant Blue G-250）是一種與蛋白質結合的化學染料。它的三苯甲烷（triphenylmethane）基團，主要與蛋白質的非極性結構結合。而它的陰離子磺酸鹽（anion sulfonate）基團與蛋白質分子的陽離子和芳香類氨基酸，尤其是精氨酸和賴氨酸側鏈的結合。在酸性環境下，其最大吸收波長從465nm轉換為595nm。Bradford提出的方法的最大優點在于不受樣品中各種化學成分的干擾。較之Lowry，Hartree-Lowry和 BCA技術，更為敏感。

 

產品內容

 

反應液（Reagent A）   50毫升

標準液（Reagent B）      1毫升

補充液（Reagent C）     5毫升

產品說明書      1份

 

保存方式

 

保存標準液（Reagent B）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；反應液（Reagent A），避免光照；有效保證3月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

比色皿或96孔板：用于樣品比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

 

實驗步驟

 

一、96孔板微量測定

 

A．建立標準樣品曲線

1．將－20℃冰箱里試劑盒中的標準液（Reagent B）置入冰槽里融化

2．準備1個96孔板，做好相應的標記

3．按下表配制標準樣品反應液

1）分別移取適量的標準液（Reagent B）到96孔板里指定序號的樣品孔里

2）分別移取適量的補充液（Reagent C）到96孔板里指定序號的樣品孔里

3）最后分別加入200微升反應液（Reagent A）

 

序號	標準液（Reagent B）	補充液（Reagent C）	反應液(Reagent A)	標準樣品蛋白質含量 （微克）
1	10微升	0	200微升	10
2	5微升	5微升	200微升	5
3	2.5微升	7.5微升	200微升	2.5
4	1.25微升	8.75微升	200微升	1.25
5	0	10微升	200微升	0

4．輕輕搖動96孔板，混勻反應物

5．室溫下暗室里孵育5分鐘

6．即刻放進酶標儀測定：波長為595nm

7．構建蛋白質濃度標準曲線：縱座標（Y）為吸光值OD595，橫座標（X）為蛋白質含量（微克）

 

B．樣品測定

• 將待測樣品置入冰槽里融化
• 分別移取10微升待測樣品到96孔板里指定序號的樣品孔里 
• 分別加入200微升反應液（Reagent A）
• 輕輕搖動96孔板，混勻反應物
• 室溫下暗室里孵育5分鐘
• 即刻放進酶標儀測定：波長為595nm
• 根據上述標準曲線，測出待測樣品的檢測含量，再除以10微升（樣品量），獲得待測樣品的實際濃度（微克/微升）（注意：參見注意事項4）

 

二、比色皿標準測定

 

A．建立標準樣品曲線

1．將－20℃冰箱里試劑盒中的標準液（Reagent B）置入冰槽里融化

2．準備好1毫升比色皿

3．按下表配制標準樣品反應液

1）分別移取適量的標準液（Reagent B）到1毫升比色皿

2）分別加入適量的補充液（Reagent C）

3）最后分別加入1毫升反應液（Reagent A）

 

序號	標準液（Reagent B）	補充液（Reagent C）	反應液 （Reagent A）	標準樣品蛋白質含量 （微克）
1	25微升	0	1毫升	25
2	12.5微升	12.5微升	1毫升	12.5
3	6.25微升	18.75微升	1毫升	6.25
4	3.125微升	21.875微升	1毫升	3.125
5	0	25微升	1毫升	0

4．輕輕上下傾倒比色皿，混勻反應物

5．室溫下暗室里孵育5分鐘

6．即刻放進分光光度儀測定：波長為595nm

7．繪制蛋白質濃度標準曲線：縱座標（Y）為吸光值OD595，橫座標（X）為蛋白質含量（微克）

 

B．樣品測定

1．將待測樣品置入冰槽里融化

2．移取25微升待測樣品到1毫升比色皿里   

4．加入1毫升反應液（Reagent A）

5．輕輕上下傾倒比色皿，混勻反應物

6．室溫下暗室里孵育5分鐘

7．即刻放進分光光度儀測定：波長為595nm

8．根據上述標準曲線，測出待測樣品的檢測含量，再除以25微升（樣品量），獲得待測樣品的實際濃度（微克/微升）（注意：參見注意事項4）

 

注意事項

 

• 本產品為250次（96孔板測定）和50次操作（比色皿測定）包括標準曲線
• 玻璃管大量測定須另購 Bradford大量蛋白質濃度定量試劑盒（30030.2）
• 操作時，須戴手套
• 避免使用NP40作為裂解液
• 樣品濃度計算公式：

標準曲線求得蛋白含量（微克）÷樣品量（微升）＝微克/微升

• 孵育完成后即刻比色測定
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 強堿性樣品將會干擾比色檢測
• 下列化學成分和濃度范圍不會干擾比色檢測：

Acetate 0.6 M KCI 1.0 M

Acetone Malic acid 0.2 M

Adenosine 1 mM MgCl2 1.0 M

Amino Acids Mercaptoethanol 1.0 M

Ammonium sulfate 1.0 M MES 0.7 M

Ampholytes Methanol 0.5％

Acid MOPS 0.2 M

ATP 1 mM NaCl 5 M

Barbital NAD 1 mM

BES 2.5 M NaSCN 3 M

Boric acid Peptones

Cacodylate-Tris 0.1 M Phenol 5%

CDTA 0.05 M Phosphate 1.0 M

Citrate 0.05 M PIPES 0.5 M

Deoxycholate 0.1% Polyadenylic acid 1 mM

Dithiothreitol 1 M Polypeptides （MW<3000）

DNA 1 mg/ml Pyrophosphate 0.2 M

EDTA 0.1 M rRNA 0.25 mg/ml

EGTA, 0.05 M tRNA 0.4 mg/ml

Ethanol total RNA 0.30 mg/ml

Eagle’s MEM SDS 0.1%

Earle’s salt solution Sodium phosphate

Formic acid 1.0 M Streptomycin sulfate 20%

Fructose Triton X-100 0.1%

Glucose Tricine

Glutathione Tyrosine   1 mM

Glycerol 99% Thymidine 1 mM

Glycine 0.1 M Tris 2.0 M

Guanidine-HCI Urea 6 M

Hank's salt solution Vitamins

HEPES buffer 0.1 M

 

• Bradford蛋白定量方法的缺點在于：背景較高（可以設定背景為零）、線性不佳（構建線性關系良好的區段或構建非線性曲線）、試劑穩定性差（訂購后新鮮使用）
• 本公司提供系列蛋白定量檢測產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感

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