動(dòng)物糖蛋白酶解法N-糖基分解試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

動(dòng)物糖蛋白酶解法N-糖基分解試劑是一種旨在通過(guò)N-糖苷酶的特異作用序列，達(dá)到糖蛋白中的天門(mén)冬酰胺鏈接的糖基和蛋白分子分離，而獲得純化寡聚糖或蛋白分子的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種N-糖基的糖蛋白的分離純化。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作便捷，分離效率高。

技術(shù)背景

很多真核生物蛋白的主要結(jié)構(gòu)成分包含天門(mén)冬酰胺（asparagine），即N-糖基；或絲氨酸/蘇氨酸（serine/threonine）鏈接，即O-糖基的寡聚糖（oligopolisaccharide）。其作用于蛋白分類、免疫識(shí)別、受體結(jié)合、炎癥反應(yīng)、病理性和其它生物過(guò)程。寡聚糖的結(jié)構(gòu)多樣性以及磷酸化、硫化等導(dǎo)致糖蛋白的質(zhì)量和電荷的異質(zhì)性。其中N-糖基寡聚糖將增加3.5kd糖蛋白質(zhì)量。此外，唾液酸的存在與否直接影響糖蛋白的質(zhì)量和電荷。通過(guò)選擇性去糖基化（deglycosylation）處理，便于糖蛋白的氨基酸序列和晶體結(jié)構(gòu)分析、確定糖基的作用包括可溶性、抗原性、受體結(jié)合性等。去糖基化處理通常使用肼解法（hydrazinolysis）、化學(xué)法和生物酶法。肼解法可以完全去除N-和O-糖基，但同時(shí)毀損了蛋白質(zhì)成分而無(wú)法復(fù)性；化學(xué)法產(chǎn)生不完全性糖基去除，以及部分蛋白分子毀損；生物酶具有完全去糖基化，且蛋白質(zhì)不會(huì)降解。使用N-糖苷酶（N-glycanase），特異性地去除所有N-鏈接的寡聚糖，除了天門(mén)冬酰胺鏈接的N-乙酰葡糖胺（N-acetylglucosamine）。

產(chǎn)品內(nèi)容

緩沖液（Reagent A） 200微升

變性液（Reagent B）  50微升

活性液（Reagent C）  50微升

酶解液（Reagent D）       20微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)       1份

保存方式

保存酶解液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于反應(yīng)操作和保存樣本的容器

電爐：用于煮沸反應(yīng)內(nèi)容物

恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于反應(yīng)孵育

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將酶解液（Reagent D）從－20℃冰箱里取出，在冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

• 變性法

• 準(zhǔn)備1個(gè)1.5毫升離心管
• 移入30微升目標(biāo)蛋白樣品（100微克）
• 加入10微升緩沖液（Reagent A）
• 加入2.5微升變性液（Reagent B）
• 使用200微升槍頭抽吸混勻
• 煮沸5分鐘（注意：避免液體揮發(fā)）
• （選擇步驟）如果煮沸出現(xiàn)沉淀，建議使用在37℃培養(yǎng)箱里孵育24小時(shí)替代
• 室溫下靜置15分鐘
• 加入2.5微升活性液（Reagent C），混勻
• 加入1微升酶解液（Reagent D）
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育3小時(shí)
• 即刻放進(jìn)－70℃冰箱里保存
• 或進(jìn)行各種后續(xù)檢測(cè)

• 非變性法

• 準(zhǔn)備1個(gè)1.5毫升離心管
• 移入35微升目標(biāo)蛋白樣品（100微克）
• 加入10微升緩沖液（Reagent A）
• 使用200微升槍頭抽吸混勻
• 加入1微升酶解液（Reagent D）
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育72小時(shí)
• 即刻放進(jìn)－70℃冰箱里保存
• 或進(jìn)行各種后續(xù)檢測(cè)

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 本產(chǎn)品適用于N鏈接型寡聚糖糖蛋白，而不是O鏈接型
• 操作時(shí)，須戴手套
• 變性法確保完全有效切離，但蛋白天然結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；如果需要維持蛋白的酶活或抗原性，則使用非變性操作
• 酶解液（Reagent D）避免反復(fù)凍融，建議分裝 
• 酶解液（Reagent D）的切離能力取決于糖蛋白的三維結(jié)構(gòu)、鏈接元素等各種因素  
• 增加切離能力的方法是：延長(zhǎng)孵育時(shí)間（至120小時(shí)）
• 如果純化效果欠佳，建議增加使用內(nèi)切糖苷酶（endoglycosidase A）等酶切
• 本公司提供系列糖蛋白處理試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離效果滿意

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