動物糖蛋白酶解法完全糖基分解試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

動物糖蛋白酶解法完全糖基分解試劑是一種旨在通過N-和O-雙重糖苷酶的特異作用序列，達到糖蛋白中的天門冬酰胺和絲氨酸/蘇氨酸鏈接的糖基和蛋白分子分離，而獲得純化寡聚糖或蛋白分子的權威而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種糖蛋白的完全分離純化。產品即到即用，性能穩(wěn)定，操作便捷，分離效率高。

技術背景

很多真核生物蛋白的主要結構成分包含天門冬酰胺（asparagine），即N-糖基；或絲氨酸/蘇氨酸（serine/threonine）鏈接，即O-糖基的寡聚糖（oligopolisaccharide）。其作用于蛋白分類、免疫識別、受體結合、炎癥反應、病理性和其它生物過程。寡聚糖的結構多樣性以及磷酸化、硫化等導致糖蛋白的質量和電荷的異質性。其中N-糖基寡聚糖將增加3.5kd糖蛋白質量；而O-鏈接的寡聚糖的質量較之N-鏈接要小，但也呈現(xiàn)多樣化和異質性。此外，唾液酸的存在與否直接影響糖蛋白的質量和電荷。通過選擇性去糖基化（deglycosylation）處理，便于糖蛋白的氨基酸序列和晶體結構分析、確定糖基的作用包括可溶性、抗原性、受體結合性等。去糖基化處理通常使用肼解法（hydrazinolysis）、化學法和生物酶法。肼解法可以完全去除N-和O-糖基，但同時毀損了蛋白質成分而無法復性；化學法產生不完全性糖基去除，以及部分蛋白分子毀損；生物酶具有完全去糖基化，且蛋白質不會降解。同時使用N-糖苷酶（N-glycanase）和O-糖苷酶（O-glycanase），特異性地去除所有N-和O-鏈接的寡聚糖，除了天門冬酰胺鏈接的N-乙酰葡糖胺（N-acetylglucosamine）和絲氨酸/蘇氨酸（serine/threonine）鏈接的半乳糖等。

產品內容

緩沖液（Reagent A） 200微升

變性液（Reagent B）  50微升

活性液（Reagent C）  50微升

酶解液（Reagent D）       20微升

產品說明書       1份

保存方式

保存酶解液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于反應操作和保存樣本的容器

電爐：用于煮沸反應內容物

恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于反應孵育

實驗步驟

實驗開始前，將酶解液（Reagent D）從－20℃冰箱里取出，在冰槽里融化。然后進行下列操作。

• 變性法

• 準備1個1.5毫升離心管
• 移入30微升目標蛋白樣品（100微克）
• 加入10微升緩沖液（Reagent A）
• 加入2.5微升變性液（Reagent B）
• 使用200微升槍頭抽吸混勻
• 煮沸5分鐘（注意：避免液體揮發(fā)）
• （選擇步驟）如果煮沸出現(xiàn)沉淀，建議使用在37℃培養(yǎng)箱里孵育24小時替代
• 室溫下靜置15分鐘
• 加入2.5微升活性液（Reagent C），混勻
• 加入1微升酶解液（Reagent D）
• 放進37℃培養(yǎng)箱里孵育3小時
• 即刻放進－70℃冰箱里保存
• 或進行各種后續(xù)檢測

• 非變性法

• 準備1個1.5毫升離心管
• 移入35微升目標蛋白樣品（100微克）
• 加入10微升緩沖液（Reagent A）
• 使用200微升槍頭抽吸混勻
• 加入1微升酶解液（Reagent D）
• 放進37℃培養(yǎng)箱里孵育72小時
• 即刻放進－70℃冰箱里保存
• 或進行各種后續(xù)檢測

注意事項

• 本產品為20次操作
• 本產品不適用于唾液酸鏈接型寡聚糖糖蛋白
• 操作時，須戴手套
• 變性法確保完全有效切離，但蛋白天然結構發(fā)生改變；如果需要維持蛋白的酶活或抗原性，則使用非變性操作
• 酶解液（Reagent D）避免反復凍融，建議分裝 
• 酶解液（Reagent D）的切離能力取決于糖蛋白的三維結構、鏈接元素等各種因素  
• 增加切離能力的方法是：延長孵育時間（至120小時）
• 如果純化效果欠佳，建議增加使用內切糖苷酶（endoglycosidase A）或β1,4-半乳糖苷酶（β1,4-galactosidase）等酶切
• 本公司提供系列糖蛋白處理試劑產品

質量標準

• 本產品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產品經(jīng)鑒定分離效果滿意

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