全組織乙酰膽堿脂酶活性染色試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

全組織乙酰膽堿脂酶活性染色試劑是一種旨在使用水解底物硫代膽堿，還原鐵氰化物，與銅離子反應(yīng)，形成紅色或棕色不溶性產(chǎn)物，來分析全組織樣品中乙酰膽堿脂酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心改良傳統(tǒng)Karnovsky的銅-鐵氰化物方法、成功實(shí)驗(yàn)證明的。主要適用于動(dòng)物組織的乙酰膽堿脂酶活性的定性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，顯色清晰。

技術(shù)背景

乙酰膽堿脂酶（acetylcholinesterase；AChE）是四聯(lián)體絲氨酸水解酶（serine hydrolase）存在于人體大腦皮質(zhì)（cortex）的軸突（axons）和錐體細(xì)胞（pyramidal cell）中。突觸傳遞（synaptic transmission）釋放出乙酰膽堿，在乙酰膽堿脂酶的作用下，產(chǎn)生降解，并達(dá)到膽堿能傳遞（cholinergic transmission）。乙酰膽堿脂酶還參與神經(jīng)細(xì)胞分化，神經(jīng)生長（neurite extension），形態(tài)形成，膜激感性（excitability）和通透性調(diào)節(jié)，蛋白溶解等過程。乙酰膽堿脂酶催化乙酰膽堿的水解，產(chǎn)生膽堿和醋酸鹽。膽堿能神經(jīng)細(xì)胞的進(jìn)行性缺失，是阿茲罕默病的特點(diǎn)，導(dǎo)致認(rèn)知障礙和記憶喪失。基于乙酰膽堿脂酶催化底物乙酰膽堿的水解，產(chǎn)生硫代膽堿（thiocholine），還原鐵氰化物（ferricyanide），與銅離子發(fā)生反應(yīng)，形成棕色沉淀復(fù)合物，用于定位組織細(xì)胞中乙酰膽堿脂酶的活性。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）  150毫升

染色液（Reagent B）   30毫升

反應(yīng)液（Reagent C）    3毫升

固定液（Reagent D）   30毫升

產(chǎn)品說明書    1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）和反應(yīng)液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于工作液配制的容器

6孔細(xì)胞培養(yǎng)板：用于樣品操作的容器

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

光學(xué)顯微鏡：用于染色后觀察分析

實(shí)驗(yàn)步驟

染色開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下融化；移取2.7毫升染色液（Reagent B）到新的15毫升錐形離心管，加入300微升反應(yīng)液（Reagent C），混勻后，標(biāo)記為染色工作液，置于冰槽里，避免光照。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備1個(gè)6孔細(xì)胞培養(yǎng)板
• 放進(jìn)新鮮切除的動(dòng)物組織樣本（注意：建議組織大小為0.5厘米厚，1厘米長；如果過大，最好刀切處理一下）
• 將組織壓平
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），清洗組織樣本
• 小心抽去清理液
• 小心加入3毫升染色工作液，浸沒整個(gè)組織
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱，孵育60分鐘，避免光照
• 小心抽去染色工作液
• 小心加上3毫升清理液（Reagent A），清洗組織樣本
• 小心抽去清理液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟9至10二次
• 小心加入3毫升固定液（Reagent D），浸沒整個(gè)組織
• 在室溫下孵育10分鐘
• 小心抽去固定液
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），清洗組織樣本
• 在室溫下孵育10分鐘
• 小心抽去清理液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟15至17二次
• 后續(xù)石蠟切片（6微米厚）或冰凍切片（10微米厚）
• 在光學(xué)顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)：表達(dá)乙酰膽堿脂酶活性的組織細(xì)胞為陽性組織細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色或棕色

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為10次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 染色液（Reagent B）和反應(yīng)液（Reagent C）避免反復(fù)凍融
• 染色工作液根據(jù)需要配制；每次可以染色5個(gè)樣本
• 試劑溶液確保鋪滿樣品表面
• 整個(gè)操作，在避光狀態(tài)下進(jìn)行
• 染色孵育時(shí)間，根據(jù)樣品和酶活性強(qiáng)弱調(diào)整，通常為1至2小時(shí)
• 肌肉組織樣品通常染色孵育時(shí)間為2小時(shí)
• 全組織染色存在其染色不均勻、組織內(nèi)部染色滲透困難等局限
• 染色后的后續(xù)處理的切片樣品可以長期保存，同樣須避免光照
• 本公司提供系列組織細(xì)胞酶活性染色試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定顯色清晰

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