生物素核酸蛋白結(jié)合凝膠電泳定量分析（McKay）試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

生物素核酸蛋白結(jié)合凝膠電泳定量分析（McKay）試劑是一種旨在通過(guò)免疫沉淀的方法，由聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳上的核酸蛋白復(fù)合物，轉(zhuǎn)移到固相膜上（如NC、PVDF）等，經(jīng)過(guò)非特異結(jié)合位點(diǎn)的封閉處理，進(jìn)行辣根過(guò)氧化酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素與膜上的生物素標(biāo)記探針直接反應(yīng)，然后加入化學(xué)發(fā)光試劑，經(jīng)X光片（放射自顯影片）感光記錄其印跡，觀察特定核酸序列和特異蛋白的相互作用，來(lái)定量分析DNA結(jié)合蛋白的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于DNA復(fù)制、重組、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、病毒組裝中的DNA和蛋白質(zhì)的相互作用的研究。廣泛應(yīng)用于定性檢測(cè)DNA結(jié)合序列和定量檢測(cè)序列特異性DNA結(jié)合蛋白（例如轉(zhuǎn)錄因子）及其突變形成等。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作便捷，敏感度高，顯影清晰，重復(fù)性好。

 

技術(shù)背景

 

DNA和蛋白質(zhì)的相互作用是調(diào)控細(xì)胞反應(yīng)過(guò)程的要素之一。McKay檢測(cè)技術(shù)是一項(xiàng)快速確定DNA序列和蛋白質(zhì)相互作用，定量和高通量分析基因調(diào)控的主要分析技術(shù)。目標(biāo)蛋白和抗體的結(jié)合，然后進(jìn)一步與目標(biāo)DNA序列發(fā)生反應(yīng)，從沉淀產(chǎn)物中，分析其結(jié)合數(shù)量：通過(guò)非放射性發(fā)光系統(tǒng)，即辣根過(guò)氧化酶使發(fā)光物（Luminol）氧化降解并發(fā)光，發(fā)射波長(zhǎng)為428nm的光，用X光片快速獲得永久的硬拷貝結(jié)果：即條帶有無(wú)或深淺。基于此，可以分辯不同空間結(jié)構(gòu)或形狀（stoichiometry或conformation）以及序列差異的復(fù)合體。同時(shí)可以直接分析取自粗提總核蛋白或細(xì)胞總蛋白的樣品。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

酶標(biāo)液（Reagent A） 200微升

補(bǔ)充液（Reagent B）      1.5毫升

親和液（Reagent C）       10毫升

結(jié)合液（Reagent D）    65毫升

強(qiáng)化液（Reagent E）    210微升

緩沖液（Reagent F）   2毫升

酶解液（Reagent G） 200微升

萃取液（Reagent H）   3毫升

濃縮液（Reagent I）   1毫升

沉淀液（Reagent J）  10毫升

凈化液（Reagent K）  10毫升

上樣液（Reagent L） 100微升

膠底液（Reagent M）  15毫升

凝結(jié)劑（Reagent N）   2毫升

促進(jìn)劑（Reagent O） 200微升

膠體液（Reagent P） 150毫升

電泳液（Reagent Q） 250毫升

轉(zhuǎn)印液（Reagent R） 125毫升

封阻液（Reagent S）       50毫升

清理液（Reagent T）      150毫升

染色液（Reagent U）  25毫升

發(fā)光液A（Reagent V）  15毫升

發(fā)光液B（Reagent W）  15毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)       1份

 

保存方式

 

保存酶標(biāo)液（Reagent A）、親和液（Reagent C）、強(qiáng)化液（Reagent E）、酶解液（Reagent G）、萃取液（Reagent H）和染色液（Reagent U）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；上樣液（Reagent L）、膠底液(Reagent M)、促進(jìn)劑（Reagent O）、膠體液（Reagent P）、染色液（Reagent U）、發(fā)光液A（Reagent V），避免光照，有效保證12月

 

用戶自備

 

無(wú)離子水：用于稀釋電泳液（Reagent Q）等

寡核苷酸探針：用于探測(cè)蛋白結(jié)合反應(yīng)

粗提核蛋白30023)或細(xì)胞總蛋白(30002)：待測(cè)樣品

純化抗體：用于免疫結(jié)合反應(yīng)

1.5毫升離心管：用于反應(yīng)操作的容器

15毫升錐形離心管：用于膠體溶液配制的容器

50毫升錐形離心管：用于膠體溶液配制和溶液混勻的容器

干式恒溫儀或恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)物

震蕩器：用于混勻反應(yīng)物

平式搖蕩儀：用于反應(yīng)物維持充分混勻

4℃微型臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀反應(yīng)物

干膠儀：用于電泳后凝膠烘干

電泳儀：用于核酸蛋白結(jié)合電泳分離

甲醇：用于轉(zhuǎn)印

PVDF固相膜：用于電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移的載體

X光片：用于發(fā)光顯影

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，移取50毫升電泳液（Reagent Q）到500毫升容器里，加入450毫升無(wú)離子水，混勻后，標(biāo)記為電泳工作液。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 探針標(biāo)記

• 開(kāi)啟37℃、70℃和95℃干式恒溫儀
• 準(zhǔn)備2個(gè)1.5毫升離心管
• 按照下表依次加入反應(yīng)物

 

內(nèi)容物	SENSE反應(yīng)	ANTISENSE反應(yīng)
酶標(biāo)液（Reagent A）	18微升	18微升
用戶自備的寡核苷酸	2微升（總量100納克）	2微升（總量100納克）
補(bǔ)充液（Reagent B）	總量至50微升	總量至50微升

 

• 分別渦旋震蕩3秒
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)瞬時(shí)離心
• 放進(jìn)37℃干式恒溫儀，孵育1小時(shí)
• 放進(jìn)70℃干式恒溫儀，孵育10分鐘
• 2管合并為1管
• 放進(jìn)95℃干式恒溫儀，孵育2分鐘
• 放進(jìn)25℃（室溫）干式恒溫儀，孵育30分鐘
• 放進(jìn)－20℃冰箱里保存或置于冰槽里備用

 

二、免疫反應(yīng)

• 移取1毫升親和液（Reagent C）到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為13000RPM（或16000g，例如eppendorf 5415D）
• 小心抽去上清液
• 加入100微升用戶自備的抗體（總量為0.5微克），混勻
• 放在平式搖蕩儀上，在4℃環(huán)境下，孵育60分鐘，速度為50RPM
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為13000RPM（或16000g，例如eppendorf 5415D）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升結(jié)合液（Reagent D），混勻
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為13000RPM（或16000g，例如eppendorf 5415D）
• 小心抽去上清液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟19至21一次
• 加入100微升結(jié)合液（Reagent D），混勻
• 加入5微升用戶自備的蛋白樣品（純化特定蛋白總量為100納克；總核蛋白總量為10至50微克；總細(xì)胞蛋白為50至100微克）
• 放在平式搖蕩儀上，在4℃環(huán)境下，孵育60分鐘，速度為50RPM
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為13000RPM（或16000g，例如eppendorf 5415D）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升結(jié)合液（Reagent D），混勻
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為13000RPM（或16000g，例如eppendorf 5415D）
• 小心抽去上清液
• 加入100微升結(jié)合液（Reagent D），混勻
• 加入0.2微升強(qiáng)化液（Reagent E），混勻

 

三、結(jié)合反應(yīng)

• 加入2微升（總量10納克）生物素標(biāo)記的寡核苷酸，混勻
• 放在平式搖蕩儀上，在4℃環(huán)境下，孵育30分鐘，速度為50RPM
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)瞬時(shí)離心2秒
• 加入20微升強(qiáng)化液（Reagent E），混勻
• 放在平式搖蕩儀上，在4℃環(huán)境下，孵育30分鐘，速度為50RPM
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為13000RPM（或16000g，例如eppendorf 5415D）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升結(jié)合液（Reagent D），混勻
• 轉(zhuǎn)移到新的1.5毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為13000RPM（或16000g，例如eppendorf 5415D）
• 小心抽去上清液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟40至43二次
• 加入180微升緩沖液（Reagent F），混勻
• 加入20微升酶解液（Reagent G），混勻
• 放進(jìn)55℃恒溫水槽孵育60分鐘
• 加入250微升萃取液（Reagent H）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為13000RPM（或16000g，例如eppendorf 5415D）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管，留下20微升相位交界面的溶液
• 加入100微升濃縮液（Reagent I）到離心管
• 加入800微升沉淀液（Reagent J）
• 在渦旋震蕩儀上強(qiáng)力震蕩30秒，充分混勻
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為13000RPM（或16000g，例如eppendorf 5415D）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升凈化液（Reagent K）
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為13000RPM（或16000g，例如eppendorf 5415D）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入10微升上樣液（Reagent L），混勻后，置入冰槽里等待上樣

 

三、垂直電泳分析

• 移出3毫升膠底液(Reagent M)到15毫升錐形離心管里
• 加入50微升凝結(jié)劑（Reagent N）
• 加入5微升促進(jìn)劑（Reagent O）
• 混勻后，即刻移入玻璃槽，避免氣泡
• 在室溫下孵育45分鐘，直至膠體凝結(jié)
• 移出30毫升膠體液（Reagent P）到50毫升錐形離心管里
• 加入300微升凝結(jié)劑（Reagent N）
• 加入30微升促進(jìn)劑（Reagent O）
• 混勻后，即刻移入玻璃槽，避免氣泡
• 插入10孔梳
• 在室溫下孵育45分鐘，直至膠體凝結(jié)
• 加入適量的含有電泳液（Reagent Q）的電泳工作液
• 在4℃環(huán)境下預(yù)運(yùn)行1小時(shí)，電壓為150伏
• 移入10微升樣品上樣到樣品孔里
• 繼續(xù)4℃環(huán)境下電泳2小時(shí)，電壓為150伏，直至染料到達(dá)膠底液和膠體液交界處

 

• 轉(zhuǎn)印

• 移出25毫升轉(zhuǎn)印液(Reagent R)到250毫升容量瓶里
• 加入50毫升甲醇
• 加入175毫升無(wú)離子水，充分混勻后，標(biāo)記為轉(zhuǎn)印工作液，放進(jìn)4℃冰箱里預(yù)冷
• 拆除電泳裝置，取出電泳玻璃板塊（注意：膠體脆弱）
• 分離玻璃板快，切除堆積膠體部分（STACKING GEL）
• 將分離膠體（RESOLVING GEL）浸泡在預(yù)冷的100毫升轉(zhuǎn)印工作液
• 剪下5 cm X 8 cm PVDF轉(zhuǎn)印膜
• 用100％甲醇浸濕PVDF轉(zhuǎn)印膜
• 取出PVDF膜，放進(jìn)50毫升轉(zhuǎn)印工作液
• 用剩下的100毫升轉(zhuǎn)印工作液使過(guò)濾紙濕潤(rùn)
• 組成三明治結(jié)構(gòu)進(jìn)行濕潤(rùn)轉(zhuǎn)印（WET TRANSFER）
• 或在4℃溫度下進(jìn)行電轉(zhuǎn)印過(guò)夜運(yùn)行：電壓50伏，電流150-200毫安或運(yùn)行3至4小時(shí)，電壓：50伏，電流為400毫安

 

五、 封阻

• 移出10毫升封阻液(Reagent S)到100毫升容量瓶里（注意：使用前，室溫預(yù)熱，搖勻封阻液）
• 加入40毫升無(wú)離子水，充分混勻后，標(biāo)記為封阻工作液
• 移出30毫升清理液(Reagent T)到500毫升容量瓶里
• 加入270毫升無(wú)離子水，充分混勻后，標(biāo)記為清理工作液
• 將5 X 8 cm2的PVDF固相膜放進(jìn)塑料盒里
• 加入50毫升封阻工作液
• 置于平式搖蕩儀上，在室溫下孵育15分鐘，速度為50RPM
• 小心倒掉封阻工作液
• 加入50毫升清理工作液
• 置于平式搖蕩儀上，在室溫下孵育5分鐘，速度為50RPM
• 小心倒掉清理工作液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟97至99一次

 

六、復(fù)合

• 轉(zhuǎn)移固相膜到新塑料盒里
• 加入5毫升染色液（Reagent U）確保液體鋪滿整個(gè)固相膜表面
• 置于平式搖蕩儀上，室溫下孵育30分鐘，速度為50RPM（注意：避免光照）
• 移去染色液（Reagent U）
• 加入50毫升清理工作液
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育5分鐘，速度為50RPM
• 移去清理工作液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟105至107三次

 

七、顯影

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將4℃冰箱里的試劑盒中的發(fā)光液A(Reagent V)和發(fā)光液B(Reagent W) 置入室溫下，分別移出3毫升到15毫升錐形離心管，混勻后標(biāo)記為發(fā)光混合液，用錫箔紙包裹，避免光照。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 加入6毫升室溫預(yù)熱的發(fā)光混合液，鋪滿整個(gè)固相膜表面
• 置于平式搖蕩儀上，在室溫下孵育1分鐘，速度為50RPM（注意：避免光照）
• 用鑷子夾起固相膜，一角放在吸水紙上，吸干發(fā)光液
• 用保鮮膜塑料紙包住
• 置于X光片夾，曝光10秒至15分

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為10次核酸結(jié)合反應(yīng)操作，5次電泳操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 建議使用單鏈DNA寡核苷酸作為標(biāo)記探針
• 建議探針標(biāo)記后即刻使用
• 長(zhǎng)標(biāo)記探針（100至500堿基）可以用于多蛋白結(jié)合檢測(cè)
• 標(biāo)記雙鏈探針可保存在－20℃冰箱里，有效保證1年；再次使用前，置于冰槽里融化
• 抗體的使用與否和多少，取決于用戶的實(shí)驗(yàn)需求
• 電泳前注意清洗樣品孔
• 電泳建議在4℃環(huán)境下進(jìn)行，注意安全
• 孵育時(shí)，避免光照。
• 半干式電轉(zhuǎn)印，運(yùn)行1小時(shí)，電壓為15至20伏
• 轉(zhuǎn)印工作液建議在4℃冰箱里預(yù)冷
• 曝光時(shí)間需根據(jù)情況調(diào)整
• 本公司提供同位素檢測(cè)產(chǎn)品
• 本公司提供系列蛋白研究產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能長(zhǎng)期穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定結(jié)合效果滿意，顯影清晰

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