蛋白質西方雜交印跡（DAB顯色）試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

蛋白質西方雜交印跡（顯色）試劑是一種旨在將復雜的蛋白混合物經SDS-PAGE分離后，轉移到固相膜上（如NC、PVDF）等，經過非特異結合位點的封閉處理， 進行辣根過氧化酶（HRP）標記的抗體與膜上的蛋白直接（標記一抗）和間接（標記二抗）反應，然后由二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）作用顯示為棕色（過氧化酶活性），以記錄其免疫印跡的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于目標蛋白的免疫學檢測。產品即到即用，性能穩定，操作便捷，檢測敏感，顯色清晰，重復性好。

 

技術背景

 

西方雜交印跡技術（Western Blot）用于檢測固定在固相免疫印跡膜上的20pg以上蛋白。辣根過氧化酶（HRP）是最常見的酶促顯色的交聯酶，其比活性高、特異性強、分子量小、穩定。HRP的生色底物顯色利用底物在HRP和過氧化氫的存在下失去電子而呈現出顏色變化和積累。二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）和HRP作用形成棕褐色不溶性產物，靈敏度高，特異性好。

 

產品內容

 

轉印液（Reagent A） 125毫升

封阻液（Reagent B）      100毫升

清理液（Reagent C） 250毫升

顯色液A（Reagent D）       10毫升

顯色液B（Reagent E)）  90毫升

產品說明書       1份

 

保存方式

 

保存顯色液A（Reagent D）在－20℃冰箱里；保存封阻液（Reagent B）和顯色液B（Reagent E）在4℃冰箱里, 其余的保存在室溫下；顯色液A（Reagent D），避免光照，有效保證6月

 

用戶自備

 

甲醇：用于配制工作液的成分

無離子水：用于配制工作液

PVDF固相膜：用于蛋白轉印的固相載體

一抗和辣根過氧化酶（HRP）標記的二抗：用于免疫結合反應

50毫升錐形離心管：用于配制工作液的容器

15毫升錐形離心管：用于配制工作液的容器

三角燒瓶：用于配制工作液的容器

塑料袋（盒）：用于清洗、封阻、結合等操作

轉印儀：用于蛋白印跡轉移的儀器

平式震蕩儀：用于孵育和混勻反應

 

實驗步驟

 

實驗開始前，準備好SDS-PAGE蛋白電泳。然后進行下列操作。

 

• 轉印

 

• 移出25毫升轉印液（Reagent A）到250毫升三角燒瓶里
• 加入50毫升用戶自備的甲醇
• 加入175毫升用戶自備的無離子水，充分混勻后，標記為轉印工作液（總共250毫升）
• 放進4℃冰箱里預冷
• 拆除電泳裝置，取出電泳玻璃板塊
• 分離玻璃板快，切除聚集膠體部分（STACKING GEL）
• 放入分離膠體（RESOLVING GEL）到塑料盒里
• 加入100毫升預冷的轉印工作液
• 同時剪下用戶自備的5 cm X 8 cm PVDF轉印膜
• 放進新的塑料盒里
• 加入50毫升用戶自備的100％甲醇浸濕PVDF轉印膜
• 倒掉甲醇
• 加入50毫升轉印工作液浸濕PVDF轉印膜
• 用剩下的100毫升轉印工作液使過濾紙濕潤
• 組成三明治結構進行濕潤轉印（WET TRANSFER）過夜
• 或在4℃溫度下進行電轉印：

選擇運行過夜：電壓50伏或電流150-200毫安

選擇運行3至4小時：電壓120伏或電流400毫安

 

• 封阻

 

• 移出20毫升封阻液（Reagent B）到100毫升三角燒瓶里（注意：使用前，室溫預熱，搖勻封阻液）
• 加入80毫升用戶自備的無離子水，充分混勻后，標記為封阻工作液
• 移出50毫升清理液（Reagent C）到500毫升三角燒瓶里
• 加入450毫升用戶自備的無離子水，充分混勻后，標記為清理工作液
• 倒掉內有PVDF固相膜的塑料盒里的轉印工作液
• 加入75毫升封阻工作液
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育45分鐘，速度為50RPM
• 小心倒掉封阻工作液
• 加入50毫升清理工作液
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育5分鐘，速度為50RPM
• 小心倒掉清理工作液
• 重復實驗步驟9至11一次

• 結合

 

• 將PVDF固相膜放進塑料袋里
• 加入10毫升含有一抗的封阻工作液（注意：一抗濃度通常為每毫升1微克）
• 將塑料袋封口
• 確保液體鋪滿整個固相膜表面
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育60分鐘，速度為50RPM
• 取出PVDF固相膜，放進塑料盒
• 加入50毫升清理工作液
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育5分鐘，速度為50RPM
• 移去清理工作液
• 重復實驗步驟7至9三次
• 將PVDF固相膜放進新的塑料袋里
• 加入10毫升含有二抗的封阻工作液（注意：二抗濃度為1：10000）
• 將塑料袋封口
• 確保液體鋪滿整個固相膜表面
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育60分鐘，速度為50RPM
• 取出PVDF固相膜，放進塑料盒
• 加入50毫升清理工作液
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育5分鐘，速度為50RPM
• 移去清理工作液
• 重復實驗步驟17至19三次

 

• 顯色

 

顯色實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的顯色液A（Reagent D）和4℃冰箱里顯色液B（Reagent E）置于室溫下，然后分別移出1毫升A液和9毫升B液到15毫升錐形離心管，混勻后標記為顯色工作液，避免光照。顯色液A（Reagent D）即刻放回－20℃冰箱里。

 

• 加入10毫升室溫預熱的顯色工作液，鋪滿整個PVDF固相膜表面
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育2至5分鐘，或直至棕褐色沉淀出現，速度為50RPM
• 用鑷子夾起固相膜，放進用戶自備的無離子水里清洗
• 空氣中晾干
• 數碼相機拍照記錄

 

注意事項

 

• 本產品為5次操作
• 操作時，須戴手套
• 如果使用半干式電轉印，則轉運運行1小時，電壓為15至20伏
• 轉印工作液建議在4℃冰箱里預冷
• 顯色時間需根據情況調整，不能過長，否則造成過度顯色
• 顯色液具有毒性或刺激性，注意操作安全
• 顯色液A（Reagent D）避免反復凍融
• 固相膜顯色后數小時將會褪色，不能永久保存
• 本產品的顯色液只能用于辣根過氧化酶（HRP）標記的雜交
• 本公司提供系列蛋白雜交試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定顯色清晰

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