通用型線粒體DNA片段常見缺失（CD4977）定性分析試劑盒產品說明書

（中文版）

主要用途

通用型線粒體DNA片段常見缺失（CD4977）定性分析試劑是一種旨在運用巢式聚合酶鏈擴增反應體系，針對各種線粒體DNA模板目標區域8224至13591堿基進行擴增，以定性分析常見缺失型擴增產物的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。廣泛應用于腫瘤、衰老等研究。產品即到即用，性能穩定，無核酶污染，操作便捷，敏感高效，重復性強。

技術背景

線粒體是母系遺傳的細胞器，進行氧化磷酸化產生ATP，提供能量于細胞。每個線粒體擁有其獨有的基因組，即線粒體DNA（mtDNA），裸露的雙鏈環狀DNA分子，約16.6kb堿基，編碼13個主要的線粒體復合物亞體。線粒體基因組不含有內顯子和有效的修復系統，容易發生突變，容易被氧化損傷。體細胞線粒體DNA突變與衰老、心血管疾病、腫瘤等密切相關。其中最為常見的突變是位于線粒體基因圖譜中8470至13446堿基位點之間的4977堿基片段缺失（ΔmtDNA4977），稱為常見缺失（common deletion；CD4977），成為自然衰老的分子標記。使用巢式聚合酶鏈擴增反應體系，針對目標區域8224至13591堿基，采用外側引物對和內側引物對，正常線粒體基因組DNA可以獲得5367堿基片段產物，而常見缺失型（CD4977）線粒體基因組DNA產生250堿基片段產物。通過使用較短的延伸時間（extending time），野生型5366堿基片段產物無法產生，唯一獲得常見缺失型擴增產物。  

產品內容

外擴液（Reagent A） 300微升

內擴液（Reagent B） 300微升

補充液（Reagent C）   1毫升

產品說明書   1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

PCR級礦物油：用于封隔反應液

PCR儀：用于樣品擴增

PCR管或平板：用于PCR反應的容器

瓊脂糖凝膠電泳：用于擴增后電泳分析

實驗步驟

實驗開始前，從－20℃冰箱中取出試劑，放進冰槽里融化。然后進行下列操作：

• 外側擴增反應

• 針對一個樣本，每次移出15微升外擴液（Reagent A）到PCR管
• 加入1微升用戶自備的的待測線粒體DNA樣品（總量100納克）
• 再加入9微升補充液（Reagent C）（反應總量為25微升）
• 即刻放進微型臺式離心機瞬時離心5秒，速度為500g（或2000RPM；例如eppendorf 5415）
• （選擇步驟）加入50微升用戶自備的PCR級礦物油（注意：參見注意事項9）
• 即刻進行第一輪熱啟動PCR反應：

• 反應完畢后，放進-20℃冰箱里保存或置于冰槽里繼續下列操作

• 內側擴增反應

• 針對一次反應，每次移出15微升內擴液（Reagent B）到PCR管
• 加入1微升上述外側反應產物
• 再加入9微升補充液（Reagent C）（反應總量為25微升）
• 即刻放進微型臺式離心機瞬時離心5秒，速度為500g（或2000RPM；例如eppendorf 5415）
• （選擇步驟）加入50微升用戶自備的PCR級礦物油（注意：參見注意事項9）
• 即刻進行第二輪熱啟動PCR反應：

• 反應完畢后，移取5微升進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳：

野生型擴增產物——351堿基

CD缺失型擴增產物——250堿基

• 如果繼續測序鑒定，膠回收PCR產物（建議使用高質純化膠回收試劑盒；20007.2）
• 進行后續的測序反應

注意事項

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 建議使用帶濾芯的槍頭，避免污染
• 在－20℃冰箱里儲存的產品避免反復凍融
• 建議樣品為純化的線粒體DNA
• 可以直接使用純化的樣品DNA進行測序
• 可以將擴增產物純化后，克隆到質粒中，然后進行測序
• 本公司提供測序引物
• 根據用戶PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）
• 本公司提供系列線粒體DNA損傷檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定無核酶污染
• 本產品經鑒定檢測準確

上海一基實業有限公司多年專供：ELISA試劑盒，PCR恒溫熒光測試盒、朗道校準品、校準質控品、標準品|對照品、抗體|抗原、生物試劑、動物血清、人類CDNA、基因組DNA、MicroRNA產品、總RNA產品、人原代細胞裂解液、生物試劑、高端試劑等系列產品。如需產品詳細說明等物理性質信息請聯系客服為您查詢！質量保證，價格優惠，是國內生物試劑權威的供應商之一，專業經銷生物科學領域的品牌試劑：Sigma試劑、ASROS試劑、AIFA試劑、alding試劑、Fisher試劑、日本MBL試劑、美國劍橋CIL氘代試劑、ATCC菌株等品牌產品。擁有齊全的生產和檢測設備，實施嚴格的管理制度和完善的質量保證體系，為廣大客戶提供全面的技術支持和完善的售后服務。歡迎來電咨詢!