通用型CHIP DNA分子庫構建試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

通用型CHIP DNA分子庫構建試劑是一種旨在通過經典的染色質免疫沉淀獲得目標DNA片段，經過末端平滑處理，亞克隆到改良型TA克隆載體，菌化產生CHIP DNA 分子庫的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于識別 DNA蛋白結合序列。廣泛應用于定量檢測序列特異性DNA結合蛋白（例如轉錄因子）及其突變形成等。產品即到即用，性能穩定，操作便捷，反應敏感，重復性好。

 

技術背景

 

DNA和蛋白質的相互作用是調控細胞反應過程的要素之一。染色質免疫沉淀分析方法（chromatin immunoprecipitation；CHIP）是研究活體內（in vivo）DNA和蛋白質的相互作用的最新最有力的工具：用于分析染色質結構動力學、轉錄因子調節、以及表觀遺傳學變異等。CHIP技術通過三大步驟實現：第一，甲醛固定后染色質分離和斷片；第二，運用特異蛋白之抗體，免疫共沉淀結合蛋白（包括轉錄因子、聚合酶、組蛋白等）的染色質片斷；第三，分析目標DNA和蛋白的修飾。其中轉錄因子作為調節蛋白，通過結合核DNA，以達到控制基因表達。通過載體亞克隆技術，可以獲得20至80克隆菌落，每個克隆的平均片段為500至1000堿基。

 

產品內容

 

緩沖液（Reagent A）  60微升

補充液（Reagent B）       10毫升

平滑液（Reagent C）       15微升

萃取液（Reagent D）   5毫升

濃縮液（Reagent E）  1.5毫升

助沉液（Reagent F）  20微升

沉淀液（Reagent G）  12毫升

凈化液（Reagent H）  20毫升

載體液（Reagent I）  15微升

反應液（Reagent J）  25微升

連接液（Reagent K）  10微升

細胞液（Reagent L）      500微升

培養液（Reagent M）   5毫升

選擇液（Reagent N）   3毫升

擴增液（Reagent O） 300微升

引物F（Reagent P）       20微升

引物R（Reagent Q）  20微升

產品說明書       1份

 

 

保存方式

 

保存濃縮液（Reagent E）和培養液（Reagent M）在4℃冰箱里；保存細胞液（Reagent L）在－70℃冰箱里，嚴禁反復凍融；其余的保存在－20℃冰箱里； 選擇液（Reagent N）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品反應操作和保存的容器

PCR管：用于DNA擴增的容器

恒溫水槽或培養箱：用于孵育反應物

震蕩器：用于混勻反應物

4℃微型臺式離心機：用于沉淀樣品

PCR儀：用于擴增反應

電泳儀：用于檢測擴增產物

瓊脂平板細菌培養皿：用于細胞克隆篩選

 

實驗步驟

 

實驗開始前，完成好染色質免疫沉淀操作。同時將－20℃保存的試劑，即刻置于冰槽里融化，即刻使用，用畢即刻放回冰箱。

 

• 目標DNA分子預處理

 

• 準備1個1.5毫升離心管
• 移取2微升待測DNA分子（總量300納克）到離心管里
• 加入6微升緩沖液（Reagent A）
• 加入11微升補充液（Reagent B）
• 加入1.5微升平滑液（Reagent C）
• 用槍頭輕輕混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育30分鐘
• 加入200微升補充液（Reagent B）
• 加入200微升萃取液（Reagent D）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進4℃微型臺式離心機瞬時離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
• 加入60微升濃縮液（Reagent E）到新的離心管
• 加入1微升助沉液（Reagent F）
• 加入600微升沉淀液（Reagent G）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩15秒，充分混勻
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升凈化液（Reagent H）
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入11微升補充液（Reagent B），直至溶解
• 放進－20℃冰箱里保存或置于冰槽里備用

 

• 載體連接

 

• 準備1個1.5毫升離心管
• 加入1.5微升載體液（Reagent I）
• 加入1微升上述制備的待測DNA分子
• 加入19微升補充液（Reagent B）
• 加入2.5微升反應液（Reagent J）
• 加入1微升連接液（Reagent K）
• 渦旋震蕩5秒
• 放進4℃微型臺式離心機瞬時離心5秒
• 放進16℃恒溫水槽孵育16小時
• 加入200微升補充液（Reagent B）
• 加入200微升萃取液（Reagent D）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進4℃微型臺式離心機瞬時離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
• 加入60微升濃縮液（Reagent E）到新的離心管
• 加入1微升助沉液（Reagent F）
• 加入600微升沉淀液（Reagent G）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩15秒，充分混勻
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升凈化液（Reagent H）
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入10微升補充液（Reagent B），直至溶解
• 放進－20℃冰箱里保存或置于冰槽里備用

 

• 細菌轉化

 

實驗開始前，準備2個100 mm的細菌培養皿，分別加入300微升選擇液（Reagent N），然后分別加入15毫升用戶自備的LB瓊脂培養基，室溫下靜置30分鐘，直至膠體凝結。

 

• 從－80℃冰箱里取出細胞液（Reagent L），置于冰槽里備用
• 移取50微升細胞液（Reagent L）到新的預冷的1.5毫升離心管
• 加入5微升上述制備的載體，手指輕彈混勻
• 放進冰槽里孵育30分鐘
• 放進42℃恒溫水槽孵育90秒
• 放進冰槽里孵育2分鐘
• 加入500微升培養液（Reagent M）
• 放進37℃恒溫搖床孵育1小時，速度為220RPM
• 分別移取50微升鋪板
• 室溫下靜置30分鐘
• 倒置放進37℃培養箱，孵育24至48小時
• 觀察菌落生長：100菌落/1次轉染

 

• PCR擴增

 

• 將擴增液（Reagent O）從－20℃冰箱里取出
• 置入冰槽里直至融化
• 針對一個反應，每次移出15微升擴增液（Reagent O）到PCR管
• 加入1微升引物F（Reagent P）
• 加入1微升引物R（Reagent Q） 
• 再加入8微升補充液（Reagent B）（反應總量為25微升）
• 用200微升槍頭輕輕點觸1個菌落，同時做好標記（注意：參見注意事項12、13和14）
• 將槍頭放進PCR管混勻
• 即刻放進微型臺式離心機瞬時離心5秒
• （選擇步驟）加入50微升PCR級礦物油（注意：參見注意事項11）
• 即刻進行熱啟動PCR反應：

 

溫度（℃）	時間	循環
95	2分鐘	1
95 58 72	30秒 1分鐘 30秒	35
72	5分鐘	1

 

• 反應完畢后，移取5微升進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳（使用常用的1kb DNA Marker）
• （選擇步驟）如果進行測序鑒定，細菌培養，質粒抽提
• （選擇步驟）使用引物F（Reagent P）或引物R（Reagent Q），進行后續的直接測序反應

 

注意事項

 

• 本產品為10次操作
• 操作時，須戴手套
• 所有操作均須在4℃狀態下進行，除另有說明外
• 嚴格按照操作規程進行
• 建議使用帶濾芯的槍頭進行分子操作
• 細胞液（Reagent L），須保存在－70℃冰箱里，嚴禁反復凍融
• 注意無菌操作，尤其是細菌鋪板
• 載體液（Reagent I）為改良型TA克隆質粒：2.7kb，Ampicillin抗性
• 引物F（Reagent P）序列為：5－GTAAAACGACGGCCAGT－3
• 引物R（Reagent Q）序列為：5－GGAAACAGCTATGACCATG－3
• 根據用戶PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）
• 菌落PCR擴增的同時，注意做好標記和后續菌落液體培養質粒繁殖
• 如果進行測序，亞克隆片段載體序列為：（下橫線是測序引物序列）

GTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCT（此為用戶克隆分子）AGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCC

• 在－20℃冰箱里儲存的產品避免反復凍融
• 本公司提供系列CHIP研究產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定不含污染性蛋白酶和核酶

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