人體端粒酶逆轉錄酶hTERT表達實時定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

人體端粒酶逆轉錄酶hTERT表達實時定量檢測試劑是一種旨在運用SYBR綠色熒光染料作為標記信號，既方便、快速地進行各種DNA模板的擴增，又實時檢測和定量分析擴增產物，即端粒酶逆轉錄酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。廣泛應用于腫瘤、衰老等研究。產品即到即用，性能穩定，無核酶污染，操作便捷，敏感高效，定量準確，重復性強，效果滿意，質量保證。

 

技術背景

 

人體端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase；hTERT），又稱hTRT、hTCS1 和hEST2，是端粒酶的核心結構，即催化亞體（catalytic subunit）。hTERT的功能性表達是端粒酶獲得活性的前提。hTERT可以激活端粒酶，使細胞獲得永生化。hTERT是端粒酶活性的限速決定成分，其mRNA表達水平與端粒酶活性之間具有密切的相關性。hTERT是一單拷貝基因，定位于5q15.33，屬于逆轉錄酶家族，具有進化上的保守性，序列總長約35kb，由16個外顯子和15個內含子組成。端粒酶特異性T-motif和7個同源保守序列的RT-motif分別位于不同的外顯子上。hTERTmRNA 還有7種不同的剪切轉錄本，分為缺失型與插入型兩類。

 

產品內容

 

引導液（Reagent A）        90微升

逆轉液（Reagent B）           162微升

補充液（Reagent C）   1.5毫升

反應液（Reagent D）  375微升

內參液（Reagent E）  375微升

染色液（Reagent F）  130微升

封隔液（Reagent G）    5毫升

產品說明書    1份

 

保存方式

 

保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；染色液（Reagent F）避免光照，有效保證6月

 

用戶自備

 

RNA樣品：用于逆轉錄擴增的模板

PCR管：用于樣品操作的容器

恒溫水槽或干式恒溫儀：用于反應孵育

微型臺式離心機：用于沉降反應物

熒光定量PCR儀：用于熒光定量PCR反應

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑和用戶自備的總RNA樣品置入冰槽里融化；同時將干式恒溫儀分別設置到70℃和37℃。然后進行下列操作。

 

一、cDNA合成

 

• 分別將融化的試劑盒里的試劑溶液渦旋震蕩2秒
• 放進微型臺式離心機瞬時離心5秒
• 移出4.5微升引導液（Reagent A）到新的0.5毫升PCR管
• 加入8微升用戶自備的RNA樣品（1微克總RNA樣品）
• 用槍頭混勻
• 放進70℃干式恒溫儀孵育3分鐘
• 即刻放進冰槽里
• 加入8微升逆轉液（Reagent B）
• 用槍頭混勻
• 放進微型臺式離心機瞬時離心5秒
• 放進37℃干式恒溫儀孵育60分鐘
• 即刻放進冰槽里
• 加入80微升補充液（Reagent C）稀釋，混勻
• 置入冰槽里備用或放進－20℃冰箱里保存

 

二、實時定量PCR

 

• 一次反應總量為25微升
• 分別移取15微升反應液（Reagent D）和內參液（Reagent E）到2個0.5毫升PCR管，并做好標記
• 分別加入2微升已知cDNA合成物（注意：可以根據標準曲線計算得知；參見注意事項9）
• 分別加入2.5微升染色液（Reagent F）
• 分別加入6.5微升補充液（Reagent C）到總量25微升
• 放進4℃微型臺式離心機瞬時離心5秒
• 使用1000微升槍頭加入1滴封隔液（Reagent G）（注意：參見注意事項12）
• 即刻放進熒光定量PCR儀
• 熒光定量PCR反應程序為：

溫度（℃）	時間	循環
95	2分鐘	1
95 60 72	30秒 30秒 30秒	40至45
72	5分鐘	1

• 采集數據，進行溶解曲線分析
• PCR產物置于－20℃保存備用
• 或進行瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物的特異性：hTERT片段為120bp；內參GAPDH片段為150bp

 

三、表達計算

 

hTERT表達量＝【Ct（樣品hTERT）÷Ct（樣品GAPDH）】÷【Ct（對照hTERT）÷Ct（對照GAPDH）】

 

表達量：定義為相對于正常對照樣品的hTERT表達水平

GAPDH：內參，作為調節樣品水平的參考指標

對照：用戶可以使用hTERT低表達的正常細胞或組織作為比較對照，建議使用正常淋巴細胞

 

注意事項

 

• 本產品為20次操作（包括20次cDNA合成，40次實時定量擴增）
• 操作時，須戴手套
• 本產品適合各種熒光定量PCR儀
• 建議整個操作在4℃下進行
• 必須使用帶濾芯的槍頭
• 所有器皿、離心管、液體等無RNA酶污染
• 使用時，避免污染母液
• 建議選用正常淋巴細胞作為正常對照或校正對照，以此作為評價hTERT的參考指標；用戶可以選用任何其它正常細胞或組織，例如腫瘤組織旁的正常組織等
• 建議選用hTERT陽性表達的MCF7細胞作為陽性對照，以此構建標準曲線：縱坐標（Y軸）為Ct值，橫坐標（X軸）為已知細胞量對數值或拷貝數或RNA量等，其最低有效用量作為樣品檢測量的標準
• 建議使用無模板作為陰性對照
• 內參液（Reagent E）為看家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；GAPDH）作為比較分析時樣品測試用量校正統一的參考標準
• 根據用戶PCR儀的性能，決定是否加入封隔液（Reagent D）
• 配制完成后，即刻進行擴增反應，以確保反應物的活性
• 試劑避免反復凍融
• PCR擴增反應的最初3個循環為定量基線；3至15個循環的熒光信號的10倍值為熒光閾值；熒光信號達到閾值所需的循環數為Ct值（參考圖像如下）

 

• Ct值可以作為hTERT表達的計量單位，也可以根據標準曲線轉換為表達分子數進行計量
• 本公司提供系列端粒酶活性檢測試劑產品

 

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定無核酶污染
• 本產品經鑒定反應靈敏

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