3’末端RNA探針同位素（[α³²P]ATP）聚合酶標(biāo)記試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

3’末端RNA探針同位素（[α³²P]ATP）聚合酶標(biāo)記試劑是一種旨在針對目標(biāo)片段RNA，使用polyA聚合酶的反應(yīng)，進行3’末端同位素標(biāo)記處理的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其應(yīng)用于后續(xù)克隆、親和純化（affinity purification）、RNA轉(zhuǎn)化、cDNA合成、序列分析等。適用于各種人工合成或純化的長鏈RNA分子的3’末端標(biāo)記。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作便捷，反應(yīng)敏感，同源性好。

技術(shù)背景

源自于大腸桿菌重組的酵母polyA聚合酶（poly A polymerase）催化ATP上的5’AMP殘基轉(zhuǎn)移到寡或多聚核糖核苷酸（RNA）雙分子上的3’末端羥基基團的反應(yīng)，優(yōu)先標(biāo)記長鏈RNA分子，體外修飾任何RNA分子的3’末端。

產(chǎn)品內(nèi)容

反應(yīng)液（Reagent A） 250微升

強化液（Reagent B）       80微升

補充液（Reagent C）      500微升

產(chǎn)品說明書       1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

RNA片段：用于標(biāo)記的目標(biāo)RNA分子

[α³²P]ATP同位素：用于同位素標(biāo)記

0.5毫升PCR管：用于樣品反應(yīng)操作的容器

PCR儀或干式恒溫儀：用于孵育反應(yīng)

震蕩器：用于混勻反應(yīng)物

4℃微型臺式離心機：用于沉淀樣品

液體閃爍計數(shù)器（liquid scintillation counter）：用于同位素活性測定

實驗步驟

實驗開始前，準(zhǔn)備好純化的目RNA分子；并將PCR儀或干式恒溫儀打開，設(shè)置為37℃。同時將－20℃保存的試劑，置于冰槽里融化.然后進行下列操作：

• 目標(biāo)RNA分子標(biāo)記

• 準(zhǔn)備1個0.5毫升PCR管
• 按照下表依次加入反應(yīng)物：

• 渦旋震蕩5秒
• 放進4℃微型臺式離心機瞬時離心5秒
• 放進37℃PCR儀或干式恒溫儀孵育20分鐘
• 置于4℃冰槽里，靜置15分鐘
• 使用酚氯仿法純化
• 加入10微升補充液（Reagent C）混懸沉淀顆粒
• 進行后續(xù)操作

• 放射性活性測定

• 準(zhǔn)備2個1.5毫升離心管，分別標(biāo)記為：D（樣品）和R（同位素母液）管
• 移取0.5微升上述制備的標(biāo)記RNA懸液到D管（此為整合CPM）
• 移取0.5微升同位素[α³²P]ATP母液到R管（此為總CPM）
• 即刻放進液體閃爍計數(shù)器測定
• 獲得CPM值
• 計算放射性特異活性（Specific Activity）和標(biāo)記效率（Efficiency of Incorporation）

Dt＝實際CPM  X  20（稀釋倍數(shù)）

Rt＝實際CPM  X  1（稀釋倍數(shù)）

標(biāo)記效率％（Efficiency of Incorporation）＝（Dt÷Rt）X100％

特異活性（Specific Activity）＝Dt÷0.5（微克，RNA量）

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 同位素操作須嚴格遵守規(guī)章制度
• 建議使用帶濾芯的槍頭進行分子操作
• 同位素α³²P標(biāo)記的ATP，建議使用AMERSHAM（安瑪西亞）公司
• 建議使用新鮮同位素材料
• 建議標(biāo)記后即刻使用
• 建議使用螺旋蓋的離心管制備同位素探針
• 標(biāo)記產(chǎn)物可保存在－20℃冰箱里。其半衰期為28天
• 理想標(biāo)記總活性為大于1 X 10⁸ CPM/微克RNA；整合效率為20至80％
• 本公司提供系列同位素處理試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶

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