微型RNA（miRNA）北方雜交試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

微型RNA（miRNA）北方雜交試劑是一種旨在將總微型RNA分子經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉移到固相膜上（如NC、PVDF）等，經過非特異結合位點的封閉處理， 進行同位素標記的特定RNA分子探針與膜上的目標微型RNA分子直接反應，然后X光片（放射自顯影片）感光記錄其雜交印跡的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于目標微型RNA分子的表達水平的定量檢測以及同時比較不同樣品的表達豐度。產品即到即用，無核酶污染，性能穩定，操作便捷，敏感度高，顯色清晰，重復性好。

 

技術背景

 

經典同位素北方雜交印跡技術（Northern Blot）用于檢測固定在固相印跡膜上最低可達10納克總RNA分子或1納克mRNA分子。通過放射性同位素標記系統，在雜交過程中，與印跡膜上的RNA分子結合，用X光片獲得永久的硬拷貝結果。進行微型RNA（miRNA）北方雜交的總RNA量需要20微克。

 

產品內容

 

酸性液（Reagent A） 200毫升

高緩沖液（Reagent B）      200毫升

低緩沖液（Reagent C）      500毫升

雜交液（Reagent D） 500毫升

封阻液（Reagent E）    1.5毫升

清理液A（Reagent F） 500毫升

清理液B（Reagent G） 200毫升

產品說明書          1份

 

保存方式

 

保存雜交液（Reagent D）和封阻液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

 

用戶自備

 

RNA電泳膠體：用于轉印和雜交的模板

RNA同位素探針：用于雜交的探針

無離子水：用于清洗膠體和印跡膜以及稀釋液體

塑料容器：用于清洗膠體和印跡膜操作的容器

固相膜：用于電泳后的RNA轉移的載體

濾紙：用于轉印時濕潤保護

平式搖蕩器：用于清洗、孵育和混勻反應

自動紫外光交聯儀：用于RNA于固相膜的連接

紫外光透射儀：用于觀察電泳和轉印效果

半干式電轉印儀：用于轉印

雜交箱：用于探針雜交的操作

GEIGER放射性計數器：用于測定同位素的放射性

X光片：用于發光顯影

 

實驗步驟

 

實驗開始前，完成聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳和微型RNA分子同位素標記。同時使用無離子水稀釋10倍酸性液（Reagent A）、高緩沖液（Reagent B）、低緩沖液（Reagent C）、清理液A（Reagent F）和清理液B（Reagent G）。然后進行下列操作。

 

• 預處理

 

• 放入聚丙烯酰胺凝膠膠體到塑料容器里
• 加入200毫升DEPC水，輕輕搖動塑料容器
• 小心倒掉DEPC水
• 重復上述實驗步驟1至3兩次
• 加入200毫升酸性液（Reagent A）
• 放在平式搖蕩器孵育30分鐘，速度為50RPM
• 小心倒掉酸性液（Reagent A）
• 加入200毫升高緩沖液（Reagent B）
• 放在平式搖蕩器孵育20分鐘，速度為50RPM
• 小心倒掉高緩沖液（Reagent B）
• 加入200毫升低緩沖液（Reagent C）
• 放在平式搖蕩器孵育15分鐘，速度為50RPM
• 小心倒掉低緩沖液（Reagent C）

 

二、轉印

 

A）人工轉印

• 放入印跡固相膜到塑料容器里
• 加入200毫升用戶自備的DEPC水，輕輕搖動塑料容器2分鐘（注意：同時濕潤濾紙）
• 設置轉印裝置

 

層次	內容
第一層（最低層）	塑料容器，內含150毫升 低緩沖液（Reagent C）
第二層	玻璃板
第三層	PAGE膠體
第四層	固相膜
第五層	3片GB002濾紙
第六層	4片GB004濾紙
第七層	2厘米厚綿紙
第八層	玻璃板
第九層	加上重力器

 

• 室溫下，轉印15小時
• 拆除轉印裝置，取出固相膜，做好相應標記
• 放入固相膜到塑料容器里
• 加入150毫升低緩沖液（Reagent C）
• 放在平式搖蕩器孵育3分鐘，速度為50RPM
• 小心倒掉低緩沖液（Reagent C）
• 在空氣中晾干
• 放進自動交聯儀（RNA一面向上）
• 進行紫外光交聯反應：1000微焦耳/平方厘米
• 放在紫外光透射儀上檢查轉印效果

 

B）電動轉印

1．放入印跡固相膜到塑料容器里

2．加入200毫升用戶自備的DEPC水，輕輕搖動塑料容器2分鐘（注意：同時濕潤濾紙）

3．設置轉印裝置

 

層次	內容
第一層（最低層）	半干式電轉印儀平臺
第二層	PAGE膠體
第三層	固相膜
第四層	3片GB002濾紙
第五層	4片GB004濾紙
第六層	蓋子
第七層	加上重力器

 

• 室溫下，電轉印35小時，電流恒定為3.3毫安，初始電壓為20伏
• 拆除轉印裝置，取出固相膜，做好相應標記
• 放入固相膜到塑料容器里
• 加入150毫升低緩沖液（Reagent C）
• 放在平式搖蕩器孵育3分鐘，速度為50RPM
• 小心倒掉低緩沖液（Reagent C）
• 在空氣中晾干
• 放進自動交聯儀（RNA一面向上）
• 進行紫外光交聯反應：1000微焦耳/平方厘米
• 放在紫外光透射儀上檢查轉印效果，并拍照記錄

 

• 預雜交

 

• 放入固相膜到雜交罐里
• 移出50毫升50℃預熱的雜交液（Reagent D）到雜交罐里（注意：使用前，室溫預熱，搖勻封阻液）
• 在50℃條件下滾動孵育2至16小時

 

• 雜交

 

• 加入150微升封阻液（Reagent E）到50微升同位素標記探針
• 煮沸2分鐘
• 直接加入到雜交罐里
• 在50℃條件下滾動孵育16小時

 

• 雜交后處理

 

• 取出印跡膜到塑料容器
• 加入150毫升清理液A（Reagent F）
• 放在平式搖蕩器室溫下孵育2分鐘，速度為50RPM
• 小心倒掉清理液A（Reagent F）
• 重復上述實驗步驟2至4一次
• 放進干凈的雜交罐，加入200毫升清理液B（Reagent G）
• 在50℃條件下滾動孵育90分鐘
• 取出印跡膜到塑料容器
• 加入200毫升清理液A（Reagent F）
• 放在平式搖蕩器室溫下孵育2分鐘，速度為50RPM
• 小心倒掉清理液A（Reagent F）
• 使用GEIGER 放射性計數器探測

 

六、顯影

 

1．用鑷子夾起固相膜，一角放在吸水紙上，吸干清理液

2．用保鮮膜塑料紙包住

3．置于X光片夾，放進－70℃冰箱里

4．壓片12至16小時

 

注意事項

 

• 本產品為10次操作
• 操作時，須戴手套
• 建議使用同位素探針測定微型RNA分子
• 操作時，須遵守同位素安全操作規章
• 固相膜可選用Bio－Rad的Zetaprobe GT或NEN的Genescreen Plus
• 操作時，用鑷子移動固相膜。切莫污染固相膜
• 濾紙最好選用Whatman公司濾紙
• 轉印過程中，保持膠體、固相膜、濾紙始終保持濕潤狀態
• 轉印設置時，避免膠體和固相膜之間出現氣泡
• 轉印時，注意安全
• 轉印前后，做好標記
• 壓片時間需根據情況調整
• 本公司提供系列miRNA技術產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定雜交特異

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