通用型微型RNA（miRNA）定量擴(kuò)增試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

通用型微型RNA（miRNA）定量擴(kuò)增試劑是一種旨在通過微型RNA分子的3’端Poly（A）加尾處理和通用型Oligo－dT適配體引物的使用，以及在逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）的作用下把微型RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，運(yùn)用SYBR綠色熒光染料作為標(biāo)記信號，既方便、快速地進(jìn)行體外擴(kuò)增（PCR法），又實(shí)時檢測和定量分析擴(kuò)增產(chǎn)物的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于特定微型RNA的表達(dá)、定量、基因拷貝數(shù)分析、RNA變異分析等。尤其可用于低拷貝量的微型RNA樣品。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，嚴(yán)格無核酶污染，逆轉(zhuǎn)錄效率和擴(kuò)增產(chǎn)量皆高，定量準(zhǔn)確，重復(fù)性好。

 

技術(shù)背景

 

成熟微型RNA（microRNA）分子是一種大小約21－23堿基的非編碼單鏈小分子RNA。它由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70－90個堿基大小的單鏈RNA前體（PRECURSOR）經(jīng)過DICER酶加工后生成。廣泛存在于動物或植物等生物體細(xì)胞內(nèi)，參與調(diào)節(jié)特定mRNA的蛋白質(zhì)翻譯過程來調(diào)控基因的表達(dá)。微型RNA表達(dá)具有時空和組織特異性，參與生命過程中一系列的重要進(jìn)程，包括發(fā)育進(jìn)程，造血過程，器官形成，凋亡，細(xì)胞增殖，甚至是腫瘤發(fā)生。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

修飾液（Reagent A） 200微升

補(bǔ)充液（Reagent B）  10毫升

萃取液（Reagent C）   4毫升

濃縮液（Reagent D）   2毫升

沉淀液（Reagent E）  10毫升

凈化液（Reagent F）  20毫升

引導(dǎo)液（Reagent G）  20微升

反應(yīng)液（Reagent H） 200微升

擴(kuò)增液（Reagent I） 600微升

引物R液（Reagent J）  20微升

熒光液（Reagent K） 500微升

內(nèi)參液（Reagent L）  20微升

產(chǎn)品說明書   1份

 

保存方式

 

保存濃縮液（Reagent D）、沉淀液（Reagent E）和凈化液（Reagent F）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，熒光液（Reagent K）避免光照，有效保證6月

 

 

 

用戶自備

 

微型RNA樣品：用于擴(kuò)增的模板

特定PCR上游引物：用于擴(kuò)增的特定微型RNA的啟動分子

干式恒溫儀：用于混勻物反應(yīng)的孵育

PCR管：用于逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)的容器

PCR擴(kuò)增儀：用于核酸產(chǎn)物的擴(kuò)增

1.5毫升離心管：用于微型RNA預(yù)處理的容器

4℃微型臺式離心機(jī)（例如EPPENDORF5415R）：用于沉淀核酸

渦旋震蕩儀：用于混勻反應(yīng)物

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

• 微型RNA預(yù)處理

 

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑和用戶自備的微型RNA樣品置入冰槽里融化；同時將干式恒溫儀設(shè)置到37℃。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 移取10微升用戶自備的微型RNA（總量10微克）樣品到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 加入10微升修飾液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)37℃干式恒溫儀孵育30分鐘
• 放進(jìn)冰槽里孵育1分鐘
• 加入200微升補(bǔ)充液（Reagent B）
• 加入200微升萃取液（Reagent C）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 1450）
• 小心移出190微升上層液相溶液到新的1.5毫升離心管，留下20微升相位交界面的溶液
• 加入60微升濃縮液（Reagent D）
• 加入500微升沉淀液（Reagent E）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 1450）
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升凈化液（Reagent F）
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 1450）
• 小心抽去上清液
• 空氣中晾干（表面呈濕潤狀）
• 加入9微升補(bǔ)充液（Reagent B）
• 放進(jìn)冰槽里溶解并等待后續(xù)操作

 

• 總微型RNA的cDNA合成

 

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑以及上述預(yù)處理的總微型RNA樣品置入冰槽里融化；同時將干式恒溫儀分別設(shè)置到42、60和95℃。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 分別將融化的試劑盒里的試劑溶液渦旋震蕩2秒
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心5秒，速度為2000RPM
• 移取1微升引導(dǎo)液（Reagent G）到上述預(yù)處理的樣品中，混勻
• 放進(jìn)60℃干式恒溫儀孵育5分鐘
• 置于室溫下孵育2分鐘
• 加入10微升反應(yīng)液（Reagent H），混勻
• 放進(jìn)42℃干式恒溫儀孵育60分鐘
• 放進(jìn)95℃干式恒溫儀孵育5分鐘
• 即刻放進(jìn)冰槽里
• 加入80微升補(bǔ)充液（Reagent B）進(jìn)行稀釋
• 放進(jìn)－20℃冰箱里備用

 

• 特定成熟微型RNA的cDNA擴(kuò)增定量分析

 

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的擴(kuò)增液（Reagent I），以及上述cDNA樣品置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 移出30微升擴(kuò)增液（Reagent I）到新的0.5毫升PCR管
• 加入1微升引物R液（Reagent J）
• 加入1微升用戶自備的引物F液或內(nèi)參液（Reagent L）
• 加入1微升上述稀釋的cDNA合成物
• 加入2.5微升熒光液（Reagent K）
• 加入適量的補(bǔ)充液（Reagent B）到總量50微升
• （選擇步驟）使用1000微升槍頭加入2滴礦物油（注意：參見注意事項(xiàng)11）
• 放進(jìn)PCR擴(kuò)增儀
• PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?/li>

 

溫度（℃）	時間	循環(huán)
95	10分鐘	1
95 59	15秒 60秒	35

 

• 采集數(shù)據(jù)，進(jìn)行溶解曲線分析
• PCR產(chǎn)物置于－20℃保存，直到進(jìn)行任何后續(xù)實(shí)驗(yàn)
• 移取5微升PCR產(chǎn)物進(jìn)行3.5％瓊脂糖凝膠電泳分析（陽性條帶為50至100bp）

 

• （選擇操作）初級微型RNA的cDNA擴(kuò)增定量分析

 

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的擴(kuò)增液（Reagent I），以及cDNA樣品置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 移出30微升擴(kuò)增液（Reagent I）到新的0.5毫升PCR管
• 加入1微升引物R液（Reagent J）
• 加入1微升用戶自備的引物F液
• 加入1微升上述稀釋的cDNA合成物
• 加入2.5微升熒光液（Reagent K）
• 加入適量的補(bǔ)充液（Reagent B）到總量50微升
• （選擇步驟）使用1000微升槍頭加入2滴礦物油（注意：參見注意事項(xiàng)11）
• 放進(jìn)PCR擴(kuò)增儀
• PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?/li>

 

溫度（℃）	時間	循環(huán)
95	10分鐘	1
95 59 72	20秒 30秒 20秒	40
72	5分鐘	1

 

• 采集數(shù)據(jù)，進(jìn)行溶解曲線分析
• PCR產(chǎn)物置于－20℃保存，直到進(jìn)行任何后續(xù)實(shí)驗(yàn)
• 移取5微升PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳分析（陽性條帶為200bp以上）

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 適合各種熒光定量PCR儀
• 整個操作須在4℃條件下操作
• 整個操作須戴手套，建議使用濾芯槍頭，并格外小心，防止降解RNA
• 建議所有的操作用品屬于RNA專用
• －20℃冰箱里保存的試劑，避免反復(fù)凍融
• 模板RNA可以使用總RNA，但用量需1至20微克；如果使用純化的微型RNA，用量可以5納克至1微克
• 引導(dǎo)液（Reagent G）含有46堿基通用型Oligo－dT適配體引物
• 建議用戶自備的微型RNA上游引物的設(shè)計(jì)，選擇特定微型RNA分子的全部序列；如果Tm溫度低于50，需對序列做些取舍
• 使用時，避免污染母液
• 根據(jù)用戶PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）
• 配制完成后，即刻進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以確保反應(yīng)物的活性
• 通過調(diào)節(jié)Tm溫度，達(dá)到PCR產(chǎn)物的單一性
• 成熟微型RNA的PCR產(chǎn)物大小在50至100堿基之間；微型RNA前體的PCR產(chǎn)物大小在100至200堿基之間；初級微型RNA的PCR產(chǎn)物大小在200堿基以上
• 內(nèi)參液（Reagent L）為人體U6 snRNA（U6核內(nèi)小RNA）上游引物（Tm為62℃），PCR產(chǎn)物為79堿基，作為比較分析時樣品測試用量校正統(tǒng)一的參考標(biāo)準(zhǔn)
• 建議選用人體U6 snRNA或miR－16作為陽性對照，以此構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱坐標(biāo)（Y軸）為C_T值，橫坐標(biāo)（X軸）為已知細(xì)胞量（10，100，和1000細(xì)胞數(shù)）對數(shù)值或拷貝數(shù)或RNA量等，其最低有效用量作為樣品檢測量的標(biāo)準(zhǔn)
• 建議使用無模板作為陰性對照
• PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初3個循環(huán)為定量基線；3至15個循環(huán)的熒光信號的10倍值為熒光閾值；熒光信號達(dá)到閾值所需的循環(huán)數(shù)為C_T值
• C_T值可以作為特定微型RNA表達(dá)的計(jì)量單位，也可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)換為表達(dá)分子數(shù)進(jìn)行計(jì)量
• 常用表達(dá)計(jì)算公式：2^－ΔCT，其中ΔC_T＝ C_T（特定微型RNA）－C_T（U6 snRNA）
• 本公司提供特定微型RNA分子擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)和合成
• 本公司提供系列微型RNA技術(shù)產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定嚴(yán)格無核酶污染
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定定量準(zhǔn)確

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