微型RNA（miRNA）擴(kuò)增試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

微型RNA（miRNA）擴(kuò)增試劑是一種旨在通過(guò)成熟微型RNA分子（18至26堿基）的端點(diǎn)修飾、5’和3’端適配體嫁接，以及在逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）的作用下把微型RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，采用體外擴(kuò)增DNA的方法（PCR法），進(jìn)行分析RNA構(gòu)造的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的，融合了世界上最優(yōu)勢(shì)的技術(shù)元素。其適用于廣譜或特定微型RNA的擴(kuò)增、分析、克隆、表達(dá)等。尤其可用于低拷貝量的微型RNA樣品。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，嚴(yán)格無(wú)核酶污染，逆轉(zhuǎn)錄效率和擴(kuò)增產(chǎn)量皆高，重復(fù)性好。

 

技術(shù)背景

 

成熟微型RNA（microRNA）分子是一種大小約21－23堿基的非編碼單鏈小分子RNA。它由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70－90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體（PRECURSOR）經(jīng)過(guò)DICER酶加工后生成。廣泛存在于動(dòng)物或植物等生物體細(xì)胞內(nèi)，參與調(diào)節(jié)特定mRNA的蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)。微型RNA表達(dá)具有時(shí)空和組織特異性，參與生命過(guò)程中一系列的重要進(jìn)程，包括發(fā)育進(jìn)程，造血過(guò)程，器官形成，凋亡，細(xì)胞增殖，甚至是腫瘤發(fā)生。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

修飾液A（Reagent A） 4毫升

修飾液B（Reagent B） 4毫升

嫁接液A（Reagent C）    100微升

嫁接液B（Reagent D）    100微升

萃取液（Reagent E）      8毫升

濃縮液（Reagent F）      4毫升

沉淀液（Reagent G）     15毫升

保存液（Reagent H）      1毫升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent I）    350微升

上樣液（Reagent J）    200微升

洗脫液（Reagent K）     15毫升

富集液（Reagent L）     40毫升

穿孔管 40套

濾芯管 40套

擠壓塞 1支

引導(dǎo)液（Reagent M）    140微升

逆轉(zhuǎn)液（Reagent N）    160微升

補(bǔ)充液（Reagent O）     1毫升

反應(yīng)液（Reagent P）   600微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1份

 

保存方式

 

保存修飾液A（Reagent A）、修飾液B（Reagent B）、嫁接液A（Reagent C）、嫁接液B（Reagent D）、萃取液（Reagent E）、標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent I）、引導(dǎo)液（Reagent M）、逆轉(zhuǎn)液（Reagent N）、反應(yīng)液（Reagent P）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

 

用戶(hù)自備

 

微型RNA樣品：用于擴(kuò)增的模板

15％聚丙烯酰胺尿素（8M）凝膠（12060）：用于膠純化

電泳運(yùn)行緩沖液（12061）：用于RNA電泳

DEPC處理水（12046）：用于清洗膠體

RNA染色液：用于電泳后染色

引物液（Reagent Q）：用于廣譜微型RNA擴(kuò)增的啟動(dòng)分子

特定PCR引物：用于擴(kuò)增的特定微型RNA的啟動(dòng)分子

酶解液（Reagent R）：用于微型RNA去修飾處理

純離液（Reagent S）：用于微型RNA去修飾處理后的純化

干式恒溫儀：用于混勻物反應(yīng)的孵育

PCR管：用于逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)的容器

PCR擴(kuò)增儀：用于核酸產(chǎn)物的擴(kuò)增

1.5毫升離心管：用于純化操作和保存微型RNA的容器

4℃微型臺(tái)式離心機(jī)（例如EPPENDORF5415R）：用于沉淀核酸

渦旋震蕩儀：用于混勻反應(yīng)物

電泳儀：用于微型RNA的電泳操作

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

• 成熟微型RNA預(yù)處理

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑和用戶(hù)自備的微型RNA樣品置入冰槽里融化；同時(shí)將干式恒溫儀分別設(shè)置到37℃和65℃。然后進(jìn)行下列操作。

 

A） A端處理

• 移取10微升（2微克）用戶(hù)自備的微型RNA樣品到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 加入190微升修飾液A（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)50℃干式恒溫儀孵育30分鐘
• 加入200微升萃取液（Reagent E）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 1450）
• 小心移出190微升上層液相溶液到新的1.5毫升離心管，留下25微升相位交界面的溶液
• 加入100微升濃縮液（Reagent F）
• 加入700微升沉淀液（Reagent G）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 1450）
• 小心抽去上清液，空氣中晾干（表面呈濕潤(rùn)狀）
• 加入5微升保存液（Reagent H）
• 放進(jìn)冰槽里溶解
• 加入5微升嫁接液A（Reagent C），混勻
• 放進(jìn)37℃干式恒溫儀孵育1小時(shí)
• 加入2微升上樣液（Reagent J），混勻
• 準(zhǔn)備一個(gè)變性的15％聚丙烯酰胺尿素（8M）凝膠（建議3mm厚，10條泳道，垂直電泳）
• 移取8微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent I）到新的1.5毫升離心管
• 加入2微升上樣液（Reagent J），混勻
• 將標(biāo)準(zhǔn)樣管和RNA樣品管放進(jìn)65℃干式恒溫儀孵育5分鐘
• 放進(jìn)冰槽里等待上樣
• 每孔上樣10微升（注意：標(biāo)準(zhǔn)樣和RNA樣品間隔1個(gè)泳道）
• 裝配電泳裝置，加入用戶(hù)自備的電泳運(yùn)行緩沖液，進(jìn)行電泳運(yùn)行：電壓180伏，運(yùn)行1小時(shí)或溴酚藍(lán)染料到達(dá)膠體底部
• 拆除電泳裝置，取出電泳玻璃板塊
• 分離玻璃板快
• 放入膠體在200毫升用戶(hù)自備的DEPC處理水中
• 加入適量的染色液
• 室溫下孵育5分鐘，避免光照
• 在UV透射儀上，仔細(xì)切下電泳后聚丙烯酰胺尿素凝膠上的58至66堿基區(qū)域修飾后微型RNA條帶
• 放進(jìn)穿孔離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心3分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 1450）
• 去掉帶孔離心管，確保沒(méi)有凝膠物質(zhì)殘留
• 分別加入300微升洗脫液（Reagent K）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)4℃冰箱里孵育6至16小時(shí)，期間渦旋震蕩數(shù)次
• 分別移出300微升液體到濾芯離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 1450）
• 切去2毫升離心管底部
• 用擠壓塞擠出所有膠體到濾芯離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 1450）
• （選擇步驟）轉(zhuǎn)180度方向再離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 1450）
• 去掉濾芯
• 加入1毫升富集液（Reagent L）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 1450）
• 小心抽去上清液，空氣中晾干（表面呈濕潤(rùn)狀）
• 加入10微升保存液（Reagent H）
• 放進(jìn)冰槽里溶解

 

B）B端處理

• 加入190微升修飾液B（Reagent B），混勻
• 放進(jìn)37℃干式恒溫儀孵育30分鐘
• 加入200微升萃取液（Reagent E）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 1450）
• 小心移出190微升上層液相溶液到新的1.5毫升離心管，留下25微升相位交界面的溶液
• 加入100微升濃縮液（Reagent F）
• 加入700微升沉淀液（Reagent G）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 1450）
• 小心抽去上清液，空氣中晾干（表面呈濕潤(rùn)狀）
• 加入5微升保存液（Reagent H）
• 放進(jìn)冰槽里溶解
• 加入5微升嫁接液B（Reagent D），混勻
• 放進(jìn)37℃干式恒溫儀孵育1小時(shí)
• 加入2微升上樣液（Reagent J），混勻
• 準(zhǔn)備一個(gè)變性的15％聚丙烯酰胺尿素（8M）凝膠（建議3mm厚，10條泳道，垂直電泳）
• 移取8微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent I）到新的1.5毫升離心管
• 加入2微升上樣液（Reagent J），混勻
• 將標(biāo)準(zhǔn)樣管和RNA樣品管放進(jìn)65℃干式恒溫儀孵育5分鐘
• 放進(jìn)冰槽里等待上樣
• 每孔上樣10微升（注意：標(biāo)準(zhǔn)樣和RNA樣品間隔1個(gè)泳道）
• 裝配電泳裝置，加入用戶(hù)自備的電泳運(yùn)行緩沖液，進(jìn)行電泳運(yùn)行：電壓180伏，運(yùn)行1小時(shí)或溴酚藍(lán)染料到達(dá)膠體底部
• 拆除電泳裝置，取出電泳玻璃板塊
• 分離玻璃板快
• 放入膠體在200毫升用戶(hù)自備的DEPC處理水中
• 加入適量的染色液
• 室溫下孵育5分鐘，避免光照
• 在UV透射儀上，仔細(xì)切下電泳后聚丙烯酰胺尿素凝膠上的98至106堿基修飾后微型RNA條帶
• 放進(jìn)穿孔離心管
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心3分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 1450）
• 去掉帶孔離心管，確保沒(méi)有凝膠物質(zhì)殘留
• 加入300微升洗脫液（Reagent K）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)4℃冰箱里孵育6至16小時(shí)，期間渦旋震蕩數(shù)次
• 移出300微升液體到濾芯離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 1450）
• 切去2毫升離心管底部
• 用擠壓塞擠出所有膠體到濾芯離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 1450）
• （選擇步驟）轉(zhuǎn)180度方向再離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 1450）
• 去掉濾芯
• 加入1毫升富集液（Reagent L）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 1450）
• 小心抽去上清液，空氣中晾干（表面呈濕潤(rùn)狀）
• 加入10微升保存液（Reagent H）
• 放進(jìn)冰槽里溶解

 

• 總微型RNA的cDNA合成

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的引導(dǎo)液（Reagent M）、逆轉(zhuǎn)液（Reagent N）和補(bǔ)充液（Reagent O），以及用戶(hù)自備的總微型RNA樣品置入冰槽里融化；同時(shí)將干式恒溫儀分別設(shè)置到70℃和45℃。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 分別將融化的試劑盒里的試劑溶液渦旋震蕩2秒
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5秒，速度為2000RPM
• 移出7微升引導(dǎo)液（Reagent M）到新的0.5毫升PCR管
• 加入5微升上述預(yù)處理的總微型RNA樣品
• 用槍頭混勻
• 放進(jìn)70℃干式恒溫儀孵育3分鐘
• 即刻放進(jìn)冰槽里
• 加入8微升逆轉(zhuǎn)液（Reagent N）
• 用槍頭混勻
• 放進(jìn)45℃干式恒溫儀孵育50分鐘
• 即刻放進(jìn)冰槽里
• 加入80微升補(bǔ)充液（Reagent O）進(jìn)行稀釋
• 放進(jìn)－20℃冰箱里備用

 

• 總微型RNA的cDNA擴(kuò)增

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的反應(yīng)液（Reagent P），以及cDNA樣品和引物置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 移出30微升反應(yīng)液（Reagent P）到新的0.5毫升PCR管
• 加入2微升引物液（Reagent Q）
• 加入2微升上述稀釋的cDNA合成物
• 最后加入補(bǔ)充液（Reagent O）到總量50微升
• 放進(jìn)PCR擴(kuò)增儀，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?/li>

 

溫度（℃）	時(shí)間	循環(huán)
95 57 72	30秒 30秒 30秒	35
72	5分鐘	1

 

• （選擇操作）特定微型RNA的cDNA擴(kuò)增

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的反應(yīng)液（Reagent P），以及cDNA樣品和特定引物置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 移出30微升反應(yīng)液（Reagent P）到新的0.5毫升PCR管
• 加入用戶(hù)自備的特定微型RNA引物A和B（各1微升）
• 加入2微升上述稀釋的cDNA合成物
• 最后加入補(bǔ)充液（Reagent O）到總量50微升
• 放進(jìn)PCR擴(kuò)增儀，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?/li>

 

溫度（℃）	時(shí)間	循環(huán)
95 Tm用戶(hù)設(shè)定溫度（50－62） 72	30秒 30秒 30秒	35
72	5分鐘	1

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 本產(chǎn)品直接擴(kuò)增成熟微型RNA分子，沒(méi)有總RNA的任何干擾
• 整個(gè)操作須在4℃條件下操作
• 整個(gè)操作須戴手套，建議使用濾芯槍頭，并格外小心，防止降解RNA
• 建議所有的操作用品屬于RNA專(zhuān)用
• RNA染色液建議使用SYBR Green
• 根據(jù)用戶(hù)PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）
• －20℃冰箱里保存的試劑，避免反復(fù)凍融
• 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent I）為電泳時(shí)的18和26堿基分子標(biāo)記
• 本公司提供廣譜微型RNA分子擴(kuò)增的引物
• 本公司提供特定微型RNA分子擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)和合成
• 如果需要去除所有外加的修飾，可以使用酶解液（Reagent R）和純離液（Reagent S）
• 本公司提供系列微型RNA技術(shù)產(chǎn)品
• 本公司提供技術(shù)外包服務(wù)

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定嚴(yán)格無(wú)核酶污染
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定反應(yīng)產(chǎn)量高

上海一基實(shí)業(yè)有限公司多年專(zhuān)供：ELISA試劑盒，PCR恒溫?zé)晒鉁y(cè)試盒、朗道校準(zhǔn)品、校準(zhǔn)質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)品|對(duì)照品、抗體|抗原、生物試劑、動(dòng)物血清、人類(lèi)CDNA、基因組DNA、MicroRNA產(chǎn)品、總RNA產(chǎn)品、人原代細(xì)胞裂解液、生物試劑、高端試劑等系列產(chǎn)品。如需產(chǎn)品詳細(xì)說(shuō)明等物理性質(zhì)信息請(qǐng)聯(lián)系客服為您查詢(xún)！質(zhì)量保證，價(jià)格優(yōu)惠，是國(guó)內(nèi)生物試劑權(quán)威的供應(yīng)商之一，專(zhuān)業(yè)經(jīng)銷(xiāo)生物科學(xué)領(lǐng)域的品牌試劑：Sigma試劑、ASROS試劑、AIFA試劑、alding試劑、Fisher試劑、日本MBL試劑、美國(guó)劍橋CIL氘代試劑、ATCC菌株等品牌產(chǎn)品。擁有齊全的生產(chǎn)和檢測(cè)設(shè)備，實(shí)施嚴(yán)格的管理制度和完善的質(zhì)量保證體系，為廣大客戶(hù)提供全面的技術(shù)支持和完善的售后服務(wù)。歡迎來(lái)電咨詢(xún)!